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一种新的乳腺珠蛋白(hMAM)异构体及其在乳腺癌细胞中的表达

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摘要

前言

第一部分hMAM异构体的基因克隆

第二部分hMAM异构体的生物信息学分析

第三部分构体与野生型hMAM在乳腺癌细胞中的表达

全文总结

致谢

参考文献

文献综述

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摘要

乳腺癌特异性标志物的发现有助于乳腺癌的临床诊断和转移、微转移的监测。人乳腺珠蛋白(humanmammaglobin,hMAM)是一种只在乳腺组织表达,在原发性乳腺癌及乳腺癌细胞系中表达显著增加的蛋白,其cDNA编码大约10kD的分泌性糖蛋白,在乳腺组织中与人亲脂素B(lipophilinB,又称BU101)以头尾连接形成共价复合物。hMAM乳腺组织特异性和分泌性蛋白的特点,使其在乳腺癌临床诊断上具有潜在的应用价值;其肿瘤相关抗原的特性,使其可作为肿瘤疫苗设计的靶点应用于肿瘤免疫治疗。由于对hMAM作为乳腺癌肿瘤标志物和相关抗原的认识存在一定差异,而许多研究表明乳腺癌细胞MCF-7内存在多种不同分子的异构体,本研究拟利用反转录和二次PCR的方法探讨报道为hMAM阴性的MCF-7中是否存在hMAM异构体,再对其从生物信息学和基因表达等方面进行研究,探讨其在乳腺癌临床诊断和乳腺癌疫苗设计中的价值和意义。 研究目的: 探讨hMAM是否存在分子结构有差异的异构体;生物信息学分析该hMAM异构体产生的原因和可能的功能改变,为进一步深入研究奠定基础;Real-timePCR分析野生型和异构体hMAM在乳腺癌细胞系和乳腺癌患者外周血脱落细胞中的表达情况,探讨该异构体可否作为乳腺癌标志物——hMAM的补充。 主要的内容和结果: 1.hMAM异构体的基因克隆 根据GenBank中编码hMAMcDNA序列设计特异引物,利用反转录和二次PCR方法从被认为是hMAM阴性的乳腺癌细胞系MCF-7中扩增出一个270bp的DNA片段。经多次独立重复实验证明此基因序列同GenBank中hMAMcDNA序列(279bp)相比,有9个连续碱基(236~244,GTGTTTATG)缺失,是一种hMAM的异构分子。氨基酸序列比对发现,此异构体基因的编码产物与hMAM野生型的编码产物有3个连续氨基酸[79~81,缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)、蛋氨酸(M)]的缺失。 2.hMAM异构体的生物信息学分析 (1)DNA序列分析显示该异构体hMAM同野生型hMAM一样位于人11号染色体(q12.3),其缺失的9个核苷酸位于第二内含子的RNA剪接位点的5-端剪接供体处,两种hMAM的5-端剪接供体位点和3-端剪接受体位点都符合通用内含子序列GU...AG的规律,因此推断出野生型与异构体hMAM的产生是mRNA前体发生可变剪切(alternativesplicing)的结果。 (2)蛋白质结构生物信息学分析表明野生型和异构体hMAM在分子量、等电点和蛋白结构域方面不存在较大差异,但由于3个连续氨基酸的缺失,异构体hMAM可能失去野生型属于子宫珠蛋白家族的特征。总平均亲水性(grandaveragehydropathicity,GRAVY)分析表明异构体hMAM的GRAVY值(0.017)和野生型的此值(0.112)相差甚远;疏水簇分析(hydrophobicclusteranalysis,HCA)也说明该异构体存在较小的疏水簇,异构体溶解度的改变必然影响其与BU101形成复合物的稳定性,提示可能影响此复合物的功能。与人白细胞抗原(humanleucocyteantigen,HLA)分子结合域分析表明野生型hMAM的MAM3片段同HLA结合值约是异构体hMAM对应的该片段结合值的100倍,异构体的抗原肽的变化会影响其与HLA分子的结合及转运,提示新发现的异构体可能同乳腺肿瘤的发生、发展以及免疫逃逸有关。 3.异构体与野生型hMAM在乳腺癌细胞中的表达 我们研究异构体与野生型hMAM在4株乳腺癌细胞系,10株人非乳腺癌细胞系,以及17例乳腺癌患者、10例其他癌症患者、10名乳腺良性疾病患者和10名健康人外周血样本的表达情况。采用常规real-timePCR和巢式real-timePCR方法检测hMAM的表达。结果发现:(1)hMAM具有良好的乳腺癌组织特异性。非乳腺癌细胞系中除人宫颈癌上皮细胞Hela中检出异构体hMAM以外,其他9株细胞(包括7株癌细胞和2株非癌细胞)对野生型和异构体hMAM表达均为阴性。10例非乳腺癌的癌症患者、10名乳腺良性疾病患者和10名健康人外周血中均未见hMAM任何形式的表达。(2)在乳腺癌细胞株和乳腺癌患者外周血脱落细胞中,hMAM均存在野生型、异构体型、二者皆有的混合型3种表达形式。(3)异构体可作为乳腺癌的标志物——hMAM的补充。在研究的17例乳腺癌患者中,巢式real-timePCR证实有16例为hMAM阳性,其中3例为仅表达异构体的异构体型患者,增加对异构体hMAM的检测可避免假阴性结果。(4)巢式real-timePCR的应用,可提高hMAM的检出率。在除MCF-7之外的3株乳腺癌细胞中,real-timePCR证明MDA-MB-435不表达hMAM,MDA-MB-231和SK-BR-3仅表达野生型hMAM;而巢式real-timePCR证实这3株细胞其实均是2种hMAM都表达的混合型。在检测的17例乳腺癌患者中,real-timePCR发现野生型hMAM检出率为58.8%(10/17),异构体型为76.4%(13/17);而采用巢式real-timePCR,野生型检出率上升到76.4%(13/17),异构体型上升到88.2%(15/17)。故增加对异构体hMAM的检测,同时采用巢式real-timePCR可以使hMAM检出率从58.8%(10/17)上升到94.1%(16/17)。 通过本研究,我们利用反转录和二次PCR的方法从乳腺癌细胞系MCF-7中发现hMAM的一种异构分子。DNA序列分析显示,该异构体缺失野生型hMAM第二外显子框内最后9个核苷酸,是mRNA前体发生可变剪接所致。生物信息学研究表明该异构体和野生型在疏水性和与抗原提呈分子HLA的结合方面有明显差异,提示新发现的异构体可能同乳腺肿瘤的发生、发展以及免疫逃逸有关。此异构体在乳腺癌细胞系和乳腺癌患者外周血脱落癌细胞中均有表达,hMAM的表达形式有野生型、异构体型、混合型3种。在外周血hMAM检测中,增加此异构体作为血清肿瘤标志物,同时采用巢式real-timePCR可提高hMAM的检出率。该异构体可作为乳腺癌的标志物——hMAM的补充,它的发现和研究为乳腺癌的分子诊断及乳腺癌肿瘤疫苗的设计有积极意义。

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