选择性环氧化酶2抑制剂塞来昔布抗膀胱肿瘤作用的体外实验研究和临床初步研究

摘要

膀胱肿瘤是我国泌尿外科最常见的肿瘤，其中多数为非肌层浸润性膀胱癌。膀胱肿瘤的主要特点是复发率高，可能的原因是膀胱肿瘤患者膀胱粘膜局部免疫功能低下、使得残存肿瘤容易逃避免疫监视，得以生存和形成复发。因此，非肌层浸润性膀胱肿瘤术后常辅以膀胱灌注化疗或免疫疗法以预防肿瘤复发和进展。卡介苗(BacillusCalmette-Guerin，BCG)是目前最有效的免疫治疗，有效激活膀胱粘膜局部免疫应答是其抗肿瘤作用的主要机制，但BCG膀胱灌注等治疗仍不能完全预防肿瘤的复发和进展。预防膀胱肿瘤复发和进展仍是尚未完全解决的难题。 近年来，环氧化酶2(Cyclooxygenase，COX-2)逐渐成为膀胱肿瘤研究领域的研究热点。研究表明，COX-2在正常人膀胱上皮细胞中几乎无表达，在人膀胱肿瘤细胞中表达则显著增强，它与肿瘤的分化、凋亡、血管生成等生物学行为有关，且与肿瘤分级分期、进展预后等有关。因此，COX-2可以作为膀胱肿瘤治疗的新靶点。 有关COX-2与膀胱肿瘤的研究是本实验室近年来的研究重点之一。本课题通过研究选择性COX-2抑制剂塞来昔布对BCG感染的人脐血源性树突状细胞(Cord bloodderived dendritic cell，CBDC)体外抗膀胱肿瘤免疫功能及对人膀胱肿瘤细胞株T24的体外增殖和凋亡的影响，探讨塞来昔布的抗膀胱肿瘤效应及其可能机制，并通过一个小规模临床研究，初步了解塞来昔布对BCG膀胱灌注治疗非肌层浸润性膀胱肿瘤的潜在的辅助治疗效果。 本研究主要研究内容及结果如下： 第一部分，塞来昔布对BCG感染的人CBDC体外抗膀胱肿瘤免疫功能的影响 1．首先，从人脐血中分离单个核细胞，体外诱导培养为树突状细胞(DC)，BCG刺激使其成熟。经鉴定所培养细胞具有典型DC形态学和表型特征。 2．分别加入培养基(空白对照)、BCG、BCG+PGE<,2>、BCG+塞米昔布等与DC共培养。ELISA法测定各组培养上清中Th1型细胞因子(IL-12)和Th2型细胞因子(IL-10)水平，结果显示BCG可同时增加DC的IL-12和IL-10分泌，提示无免疫漂移作用发生，而塞来昔布剂量依赖性地显著增强BCG感染DC的IL-12的表达，抑制其IL-10表达：PGE<,2>的作用与此相反，提示塞来昔布可诱导偏向Th1型而PGE<,2>可诱导偏向Th2型免疫应答的免疫漂移作用。 3．MTT法测定各组DC的混合淋巴细胞反应性(MLR)，结果显示塞来昔布显著增加、而PGE<,2>则明显抑制BCG感染的DC的混合淋巴反应性。 4．乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定各组DC：激活的细胞毒T淋巴细胞(CTL)对人膀胱肿瘤细胞株T24的细胞毒活性。结果显示，塞来昔布显著增强、而PGE<,2>则明显抑制BCG感染的DC激活CTL的抗膀胱肿瘤细胞毒活性。 第二部分，研究塞来昔布对人膀胱肿瘤细胞株T24体外增殖和凋亡的影响 1．将贴壁生长的T24细胞，分别与不同浓度塞来昔布、PGE<,2>以及PI-3K抑制剂LY294002共培养，MTT法测定塞米昔布及PGE<,2>对T24细胞增殖活性的影响；分别与CM，DMSO(0.1％)，塞来昔布、PGE2以及LY294002共培养，流式细胞仪测定塞来昔布及PGE<,2>处理后T24细胞的凋亡率。结果显示塞来昔布呈剂量依赖性显著抑制贴壁生长的T24细胞的增殖，增加T24细胞的凋亡；而PGE<,2>和对贴壁生长的T24细胞增殖和凋亡无明显影响。 2．建立细胞悬浮培养体系，将悬浮生长的T24细胞，分别与(2M，DMSO，塞来昔布、PGE<,2>以及LY294002共培养，流式细胞仪测定塞米昔布及PGE<,2>处理后T24细胞的凋亡率(失巢凋亡，即脱壁作用诱导的凋亡现象)；分别与塞来昔布、PGE<,2>共培养，Western blot法检测塞来昔布及PGE<,2>对PI-3K/Akt途径活化的影响。结果表明，塞来昔布和LY294002显著增加T24的失巢凋亡，而PGE<,2>显著抑制T24细胞的失巢凋亡。Western blot结果提示，塞来昔布抑制、而PGE<,2>明显增加Akt磷酸化，提示塞来昔布和PGE<,2>对PI-3K/Akt途径活化分别具有降低或增强作用，并且这种作用可能是对失巢凋亡的增强或抑制作用机制之一。 第三部分，口服塞来昔布胶囊对BCG膀胱灌注治疗非肌层浸润性膀胱肿瘤疗效影响的临床初步研究。 42例非肌层浸润性膀胱癌术后患者随机分为2组，分别接受单纯BCG治疗和BCG膀胱灌注加塞来昔布胶囊口服联合治疗。ELISA法测定治疗前后尿液细胞因子水平，观察复发和进展以及治疗相关副作用等情况，分析影响对塞米昔布治疗的反应性的因素。结果显示： 1．两组患者治疗前尿液IL-12、IL-10水平的差异无显著性统计学意义，治疗后联合治疗组IL-12水平以及其治疗前后增加值均显著高于单纯BCG组，而治疗后IL-10水平以及其治疗前后增加值均显著低于单纯BCG组，提示塞来昔布可诱导BCG激活的膀胱局部免疫应答发生偏向Th1型的免疫漂移，从而增强膀胱局部的抗肿瘤免疫功能。 2．由于随访时间较短，目前尚不能得出塞米昔布对BCG膀胱灌注预防膀胱肿瘤复发和进展疗效影响的准确结论。 3．单纯BCG治疗组与联合治疗组比较，治疗副作用无明显差异。 4．对尿液细胞因子水平进行的预后因素影响分析结果提示：65岁以上年龄组对塞来昔布治疗的反应性强于65岁以下年龄组；男性患者治疗反应性强于女性患者；高分期、分级以及多发、直径大的肿瘤治疗反应性降低。其机制有待研究。 全文结论： 1．塞来昔布可增强BCG激活的Th1型免疫应答，抑制Th2型应答，诱导向Th1型应答漂移，从而增强BCG激活的抗肿瘤免疫效应。其机制是通过抑制COX-2活性下调PGE<,2>的表达，从而抑制PGE<,2>诱导的DC的Th2型细胞因子IL-10分泌及其对Th1型细胞因子IL-12的拮抗作用，使得IL-12表达升高。 2．塞来昔布具有双重抗肿瘤作用，即对BCG激活的免疫应答的增强作用，以及直接对膀胱肿瘤细胞增殖的抑制作用和凋亡的诱导作用。两种作用均与塞来昔布对COX-2的抑制有关。 3．塞来昔布对膀胱肿瘤失巢凋亡诱导作用具有重要的临床意义，提示其潜在的降低膀胱肿瘤术后复发和转移的作用。这种诱导作用可能是通过其对PI-3K/Akt途径活化的抑制实现的。 4．临床初步研究证实，塞来昔布可诱导BCG激活的膀胱局部免疫反应产生向Th1免疫应答的极性漂移，提示塞来昔布可增强BCG膀胱灌注治疗膀胱肿瘤临床疗效。年龄、分级分期、肿瘤数目和大小等均可影响对塞来昔布治疗的反应性，但其影响机制有待研究。

目录

论文说明：英文缩写一览表

声明

摘要

前 言

第一部分选择性环氧化酶2抑制剂塞来昔布对卡介苗感染的人脐血源性树突状细胞体外抗膀胱肿瘤免疫功能的影响

材料和方法

结 果

讨论

小 结

第二部分选择性环氧化酶2抑制剂塞来昔布对人膀胱肿瘤细胞株T24体外增殖和凋亡的影响

材料和方法

结 果

讨 论

小 结

第三部分口服塞来昔布胶囊对BCG膀胱灌注治疗非肌层浸润性膀胱癌疗效影响的临床初步研究

材料和方法

结 果

讨 论

小 结

全文结论

致 谢

照片一

照片二

参考文献

附录

综述环氧化酶2在膀胱肿瘤的研究进展

攻读博士学位期间发表论文情况