APE/Ref-1在大鼠螺旋神经节细胞表达调控及氧化损伤过程中作用机制的研究

摘要

研究背景： 听觉神经元损伤是感音神经性耳聋的主要原因之一。近年研究发现耳毒性聋、噪声性聋、老年性聋以及耳蜗缺血再灌注损伤，都与活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)氧化应激损伤有关，氧化损伤是内耳听神经元损伤的基本病理过程。无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子-1(apurinic/apyrimidimic endonuclase/redoxfactorl，APE/Ref-1)是一种具有DNA修复、氧化还原以及调节转录因子活性的多功能蛋白，尽管有研究表明其在多种细胞抗氧化损伤过程中起重要的作用，但其在耳蜗螺旋神经节细胞(spiral ganglion cells，SGCs)的表达及其在氧化损伤过程中的作用并不清楚。本研究对SGCs进行体外培养，并建立体外氧化损伤模型，对APE/Ref-1在体内、外螺旋神经节细胞的表达进行检测，并利用腺病毒载体基因转染技术与RNA干扰技术对APE/Ref-1在SGCs表达进行正、反调控，研究APE/Ref-1在螺旋神经节氧化损伤中的作用。为螺旋神经节氧化损伤保护研究提供理论依据。 研究目的： 探讨APE/Ref-1在耳蜗螺旋神经节氧化损伤过程中的作用及其机制，为螺旋神经节氧化损伤保护研究提供理论依据。 研究方法： 1．通过免疫组织化学技术初步了解APE/Ref-1蛋白在耳蜗组织的表达。 2．体外分离并培养大鼠螺旋神经节细胞48小时后，采用不同浓度H202(0，10,25,50，100,300μmol/L)干预1小时，换正常培养基继续培养24小时后，采用MTT方法、TUNEl方法分别检测螺旋神经节在H<,2>O<,2>氧化环境下细胞活力、细胞凋亡情况。 3．构建重组腺病毒载体Ad-APE/Ref-1，转染体外培养螺旋神经节细胞，通过指示蛋白绿色荧光蛋白(GFP)的表达，检测不同倍数(MOI)的感染率，以及感染后24h，48h和72h时GFP表达感染率，确定合适的感染倍数和病毒表达时间。 4．采用RT-PCR和Western Blot检测Ad-APE/Ref-1感染螺旋神经节细胞内APE/Ref-1的mRNA和蛋白表达。检测通过腺病毒感染介导能否有效的引起螺旋神经节细胞过度的表达APE/Ref-1。采用MTT方法、TUNEL方法分别检测转染后螺旋神经节在H<,2>O<,2>氧化环境下的细胞活力、细胞凋亡情况。 5．构建靶向APE/Ref-1基因短发夹状干扰RNA(short hairpin RNA，shRNA)表达载体PGenesill-APE/Ref-1，并采用LipofectaminieTM2000脂质体将其转染螺旋神经节细胞。根据绿色荧光指示蛋白估计感染率。 6．采用RT-PCR和Western Blot检测PGenesill-APE/Ref-1感染螺旋神经节细胞内APE/Ref-1的mRNA和蛋白表达。检测通过RNA干扰是否有效的抑制了APE/Ref-1在螺旋神经节细胞的表达。采用MTT方法、TLINEL方法分别检测转染后螺旋神经节在H<,2>O<,2>氧化环境下的细胞活力、细胞凋亡情况。 研究结果： 1．APE/Ref-1在大鼠耳蜗螺旋神经节、螺旋韧带、血管纹、Corti器部位有较高表达，阳性细胞成棕黄色。 2．在培养条件下SGCs生长良好，接种24小时后可见典型的双极神经元，极少数成三极神经元。48小时后，SGCs长出较长的突起，培养4天后，SGCs突起进一步伸长，交织成网络，非神经细胞停止增殖。培养8天后细胞开始死亡，10天后存活细胞明显减少，不能传代培养。培养48小时后用神经元特异烯淳化酶(NSE)抗体进行免疫学鉴定，大部分SGNs全细胞呈现红色免疫荧光，胞核明显，少数仅胞体染色。 3．随H<,2>O<,2>浓度升高，细胞活性呈现下降趋势，H<,2>O<,2>浓度为50，100,300uml/L时，OD值分别为0.1917±0.0217，0.1542±0.0165，0.1322±0.0151，与对照组比较有统计学意义，P值均小于0.01。而细胞凋亡呈明显上升趋势，H<,2>O<,2>浓度为50,100,300uml/L时，螺旋神经节细胞的凋亡率分别为14.41±1.68％，25.52±1.71％，43.51±2.13％，与对照组之间差异具有统计学意义，P值均小于0.01。 4．通过同源重组，在AD293细胞内产生了具有感染能力的Ad-APE/Ref-1腺病毒颗粒；通过反复感染过程，获得较高滴度腺病毒液。 5．Ad-APE/Ref-1、Ad-GFP感染SGCs后，GFP表达阳性随MOI和时间增加而增加；MOI到达150以上时，细胞GFP阳性率达到90％以上，感染48小时后，GFP阳性表达趋于稳定，因此确定感染48小时后作为进行后续实验的适宜时间。 6．RT-PCR和Wetem Blot结果显示，携带外源基因APE/Ref-1的腺病毒后，SGCs能够过度表达APE/Ref-1的mRNA和蛋白。 7．MTT结果显示：APE/Ref-1在SGCs过表达后，螺旋神经节细胞在H<,2>O<,2>(50，100，300μmol/L)氧化环境中细胞活性相对于对照组显著升高(P<0.01)。而细胞凋亡相对于对照组成下降趋势。(P<0.01)。 8．在大鼠APE/Ref-1全长序列中选取含21个核苷酸靶序列，设计形成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pGenesil-1中，获得可靶向抑制APE/Ref-1基因的重组shRNA(short laairpin RNA，shRNA)表达载体PGenesill-APE/Ref-1。 9．采用Lipofectamine<'TM>2000脂质体将PGenesill-APE/Ref-1转染到螺旋神经节细胞，继续培养72小时后，RT-PCR和Wetem Blot结果显示，APE/Ref-1在螺旋神经节细胞的表达受到抑制，约40～50％。 10．APE/Ref-1在螺旋神经节细胞表达受到抑制后，螺旋神经节细胞在H<,2>O<,2>(25，50，100,300μmol/L)氧化环境中细胞活性相对于对照组显著降低。而细胞凋亡相对于对照组成上升趋势，有统计学意义，P<0.05。 结论： 1．APE/Ref-1在耳蜗螺旋神经节、螺旋韧带、血管纹、Corti器部位有较高水平的表达。 2．成功分离并培养出大鼠SGCs，通过不同浓度H<,2>O<,2>诱导SGCs氧化损伤，建立了SGCs体外氧化损伤模型。 3．成功构建了腺病毒载体Ad-APE/Ref-1。 4．通过重组腺病毒介导，SGCs细胞内APE/Ref-1过度表达能够显著提高SGCs的抗氧化能力，提示APE/Ref-1过表达对SGCs细胞氧化损伤有保护作用。 5．成功构建了靶向抑制APE/Ref-1基因的重组shRNA表达载体PGenesill-APE/Ref-1。 6．通过RNA干扰，抑制SGCs细胞APE/Ref-1蛋白表达能够降低螺旋神经节细胞的抗氧化能力，提示APE/Ref-1对SGCs在氧化环境中的存活起着关键作用。 7．APE/Ref-1对SGCs的氧化损伤保护可能是通过DNA修复作用与氧化还原作用抑制细胞凋亡来实现的。

目录

论文说明：英文缩写一览表

声明

摘要

前 言

第一部分 APE/Ref-1在大鼠耳蜗的表达研究

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第二部分 螺旋神经节细胞体外培养及体外氧化损伤模型的建立

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

照 片

第三部分 APE/Ref-1对螺旋神经节细胞氧化损伤影响实验研究

分题一 APE/Ref-1基因重组腺病毒的构建表达和鉴定

材料与方法

结 果

小 结

照 片

分题二 Ad-APE/Ref-1对培养螺旋神经节细胞氧化损伤作用影响研究

材料与方法

结 果

小 结

照 片

分题三 APE/Ref-1特异性shRNA对螺旋神经节氧化损伤影响研究

材料与方法

结 果

小 结

讨 论

照 片

全文结论

致 谢

参考文献

文献综述一 活性氧自由基对耳蜗氧化应激损伤机理研究

文献综述二 多功能蛋白APE/Ref-1研究进展

在读期间发表论文情况