过氧化氢诱导的MRC-5细胞氧化损伤中APE/Ref-1变化

摘要

目的：研究不同浓度的过氧化氢(H2O2)诱导人胚肺成纤维细胞(MRC-5)氧化损伤,确定最佳H2O2作用浓度的MRC-5细胞模型,检测无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子l(apurinic/apyrimidinic endonuclease/redox factor-1,APE/Ref-1)和APE/Ref-1氧化还原反应活性的重要辅因子--硫氧还蛋白(thioredoxin,TRX)表达变化.rn 方法：将培养的MRC-5细胞随机分组:空白对照组、200, 400, 600,800,1000,1200,1400，1600Euno1/L的H2O2组，分别孵育6,12,24 h;。通过H2O2作用于MRC-5细胞建立细胞氧化损伤模型，使用MTT法检测H2O2对MRC-5细胞的增殖抑制率，待H2O2作用的MRC-5细胞氧化损伤模型建立后，用最佳H202浓度作用于MRC-5细胞，采用免疫荧光检测MRC-5细胞中DNA氧化损伤情况的8-羟脱氧鸟苷(8-OHdG)含量;应用流式细胞术检测MRC-5细胞的凋亡;采用反转录PCR分析TRX和APE/Ref-1 mRNA的表达;Western blot法检测TRX和APE/Ref-1蛋白水平的变化。rn 结果：与对照组相比，不同浓度的H2O2对MRC-5细胞均有损伤作用，细胞增殖的抑制程度随H2O2浓度升高而增强，随时间延长呈递增趋势，当H2O2浓度800μmol/L孵育24h时，细胞存活力下降至47.25%。由此建立800μmol/L的氧化损伤细胞模型。对照组8-OHdG荧光强度为0.54±0.13, H2O2模型组MRC-5的8-OHdG荧光强度为0.98±0.15，与对照组比较差异有显著性(P＜0.05);对照组凋亡率为1.63%±0.89%，H2O2模型组MRC-5细胞的早期凋亡率为20.70%±2.21%，模型组凋亡细胞增多(P＜0.01);H2O2模型组与对照组比较，TRX和APE/Ref-1mRNA和蛋白表达均降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。rn 结论：H2O2引起MRC-5细胞氧化损伤，APE/Ref-1和TRX表达在H2O2诱导的氧化损伤MRC-5细胞中表达减低。