脾虚证患者和健康人酸刺激前后唾液淀粉酶活性差异及其机制研究

摘要

目的：比较脾虚证患者和健康人酸刺激前后唾液分泌和唾液淀粉酶活性的差异，探讨两者酸刺激前后sAA活性差异的机制，为“脾主涎”理论和脾虚证的临床诊断提供依据。
　　方法：1.临床实验：征集脾虚证患者与健康人各30例，定时采集他们柠檬酸刺激前后的全唾液样本，测定唾液流率、pH值和总蛋白含量，测定sAA活性、sAA含量和AMY1拷贝数。（1）比较脾虚患者和健康人刺激前的和刺激后的唾液样本各测定值，再分别比较两组刺激前后各测定值的差异性。（2）分析两组sAA活性与sAA含量、AMY1拷贝数之间的相关性。2.动物实验：(1)选取SD大鼠雌性30只，建立大鼠酸刺激前后唾液采集方法；（2）另选取48只SD雌性大鼠，SPF级条件饲养。随机分为脾虚模型组(n=24)和正常对照组(n=24)，脾虚模型采用利血平法复制。采集两组大鼠酸刺激前后全唾液样本并测定其sAA活性。（3）随机将脾虚大鼠分为脾虚对照组、脾虚+激动剂组、脾虚+阻断剂组，随机将正常大鼠分为正常对照组、正常+激动剂组、正常+阻断剂组。采集大鼠酸刺激前后全唾液并测定其sAA活性。取完唾液样本即刻解剖摘取腮腺组织，测定腮腺组织sAA活性、 sAA含量、cAMP含量、β-AR受体表达量。①组内比较两组大鼠酸刺激前后的唾液样本差异性，组间比较脾虚大鼠和正常大鼠刺激前的和刺激后的唾液样本。②组间比较脾虚对照组和正常对照组腮腺组织的各测定指标的差异性。③观察激动剂和阻断剂对两组大鼠的干预作用。
　　结果：1.临床实验：（1）①脾虚患者刺激前的唾液样本除了在 pH值上比健康人的显著高，其它没有显著差异；脾虚患者酸刺激后的唾液样本的流率、总蛋白含量、sAA活性、sAA比活和sAA含量显著低于健康人的，但pH值无差异；脾虚患者和健康人的AMY1拷贝数没有显著差异；②脾虚患者酸刺激前后各指标差异不显著，除总蛋白含量比值小于1，其余各指标酸刺激前后比值均略大于1；而健康人的刺激前后各指标差异显著，各指标酸刺激后比酸刺激前比值均大于1。两组sAA活性比值差异显著。
　　（2）两组唾液样本的sAA活性和sAA含量之间存在显著的正相关（健康人刺激前r=0.61，刺激后r=0.67；脾虚患者刺激前r=0.69，刺激后r=0.72），刺激前的sAA活性与AMY1拷贝数显著相关（健康人r=0.52，脾虚患者r=0.51），刺激后无相关性。两组的sAA活性比值与sAA含量比值之间存在显著相关性（健康人r=0.85；脾虚患者r=0.36），然而，健康人sAA活性比值与AMY1拷贝数无显著相关性，而脾虚患者则有显著相关性（r=0.45，P<0.05）。
　　2.动物实验：（1）大鼠唾液样本采集方法探索，结果得出以0.4 mol/L0.50×0.50 cm柠檬酸滤纸，每隔2.5 min刺激大鼠舌尖30 s，采集酸刺激后全唾液的方法，能显著增加大鼠sAA活性和流率（P<0.05），刺激前sAA活性与流率有显著正相关性（P<0.05），刺激后sAA活性与流率有显著负相关性（P<0.05）。
　　（2）脾虚大鼠建模11天的体重变化比较健康大鼠显著下降，建模第11天出现典型脾虚症状，脾虚大鼠表现为双目懒睁、扎堆、弓背、毛色不泽、大便溏软。
　　（3）①脾虚大鼠刺激前后无显著差别，正常大鼠则显著增加；两组刺激前的样本无显著差异性，刺激后的差异显著。②比较两组腮腺的各项指标，脾虚大鼠腮腺中的sAA活性和sAA含量显著高于正常大鼠，β1-AR表达显著降低，β2-AR表达显著高，cAMP含量显著降低。③激动剂能显著增加两组大鼠唾液的sAA活性，显著降低两组大鼠腮腺的sAA活性和sAA含量，对cAMP、β-AR受体影响不明显；阻断剂影响结果不明显。
　　结论：脾虚患者对酸刺激的敏感性降低是脾虚患者酸刺激前后 sAA活性比值下降的原因。脾虚患者酸刺激后sAA活性低下与sAA含量有关，且具有AMY1拷贝数变异的遗传学基础。脾虚大鼠受体表达障碍，引起分泌调控通路的障碍，据此得出脾虚患者存在急性分泌功能低下。

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第一章 引言

1.1脾的生理功能

1.2脾虚证与唾液淀粉酶的相关性

1.3影响唾液淀粉酶（sAA）活性的因素

1.3.1 AMY1基因拷贝数变异与sAA活性

1.3.2 sAA含量和N-糖基化sAA含量与sAA活性

1.3.3β-AR介导的分泌调控与sAA活性

1.3.4唾液的采集方法与sAA活性

1.3.5影响sAA活性的其它因素

1.4研究目的和研究意义

第二章 脾虚患者与健康人唾液淀粉酶差异研究

2.1实验材料和仪器

2.1.1实验样本来源

2.1.2主要仪器和试剂

2.1.3主要试剂配方

2.2实验方法

2.2.1亚健康脾虚证和健康人群纳入标准

2.2.2唾液样本的采集

2.2.3唾液样本的处理

2.2.4唾液流率和pH值的测定

2.2.5总蛋白和sAA含量测定

2.2.6 sAA活性和sAA比活的测定

2.2.7 AMY1拷贝数测定

2.2.8统计学分析

2.3实验结果

2.3.1脾虚患者和健康人的各项测定指标的比较

2.3.2脾虚患者和健康人的各项测定指标酸刺激前后的比值的比较

2.3.3脾虚患者和健康人的sAA含量、AMY1拷贝数对sAA活性的相关性分析

2.4讨论

第三章 脾虚大鼠和正常大鼠sAA活性和分泌机制的研究

3.1实验材料和仪器

3.1.1实验动物

3.1.2主要仪器和试剂

3.1.3主要试剂配方

3.2实验方法

3.2.1大鼠唾液采集方法的建立

3.2.2脾虚动物模型的建立

3.2.3大鼠腮腺组织的摘除

3.2.4大鼠唾液样本和腮腺组织sAA活性的测定

3.2.5大鼠腮腺组织的cAMP测定

3.2.6 大鼠腮腺组织的sAA含量、β1-AR和β2-AR受体表达的测定

3.2.7统计学分析

3.3结果

3.3.1大鼠酸刺激前后唾液采集方法

3.3.2脾虚动物模型的建立

3.3.3脾虚大鼠和正常大鼠酸刺激前后sAA活性改变机制研究

3.4讨论

第四章 总结与展望

参考文献

附录

附1 唾液和血液标本采集知情同意书

附2 亚健康脾气虚证护士临床证候观察表

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢