阻断泛素—核因子-κB信号通路防治慢性肾衰加速性动脉粥样硬化的实验研究

摘要

背景与目的： 心血管疾病是终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)患者最常见的并发症和最主要的死亡原因。其中尿毒症动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)倍受关注。慢性肾衰竭患者发生AS与普通人群不同，具有发病率高、发病年龄早、病变累及广泛等自身特点，其发病机制尚不十分清楚。传统的危险因素如：高血压、糖尿病、血脂代谢紊乱等虽在CRF病人中也较为普遍，但并不能满意解释慢性肾衰竭(chronic renal failure，CRF)病人心血管疾病如此高的发病率和死亡率，提示慢性肾衰竭患者体内可能有其它因素加速了动脉粥样硬化的发生发展。已明确AS实质是血管壁细胞的慢性损伤性炎症反应，但目前仍缺乏有效的防治手段。ESRD患者具有严重的内环境紊乱，体内存在“微炎症状态”，这种微炎症状态可能和其动脉血管细胞慢性损伤性炎症反应有关，加速了动脉粥样硬化的进展。 核因子-κB(NF-κB)是一种具有多向调控作用的转录因子，存在于多种不同的细胞类型中，处于炎症反应网络的中心位置，研究其生物学特性并通过药理学作用适当地进行调控，对于防治组织细胞炎症反应的发生发展具有重要的临床意义。近来的研究发现，泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)是一种广泛存在于真核细胞胞浆中非常重要的、依赖ATP的非溶酶体蛋白降解通路，可从多个环节参与调控NF-κB信号通路。且UPP组分具有明确的组织特异性，为靶向性地针对血管细胞NF-κB活化提供了可能。 本课题通过建立慢性肾衰兔模型和体外细胞培养两层次观察UPP-NF-κB信号组份在慢性肾衰加速性动脉粥样硬化发生发展过程中的表达和活化规律，分析阻断泛素-蛋白酶体信号途径对慢性肾衰主动脉血管细胞炎症病理变化的影响，为临床有效防治慢性肾衰加速性动脉粥样硬化提供理论依据。 方法： 1.采用结扎左肾动脉分支并切除右肾的方法建立慢性肾衰竭兔模型，将动物随机分为假手术组(Sham)、慢性肾衰组(CRF)、假手术+MG132组(Sham+MG132)、慢性肾衰+MG132组(CRF+MG132)、假手术组+PDTC组(Sham+PDTC)、慢性肾衰+PDTC组(CRF+PDTC)。各组设术后4w、8w、12w三时相点，动态观察血压、肾功能、血脂、肾脏及主动脉病理变化情况。 2.采用慢性肾衰模型12 w兔血清刺激体外培养的兔主动脉内皮细胞和平滑肌细胞，MTT、流式细胞仪及Hoechst33342染色检测内皮细胞和平滑肌细胞的形态增殖、凋亡的变化。并采用MG132和PDTC进行干预，观察其对细胞增殖的量效和时效情况。 3.免疫组化检测主动脉中增殖细胞核抗原(PCNA)的表达变化。 4.应用RT-PCR方法检测各组兔主动脉及体外培养细胞泛素(Ub)、泛素激活酶(E1)、NF-κBp65及IκBα mRNA表达变化。 5.Western blot检测主动脉及体外培养细胞泛素化蛋白、E1、NF-κB、IκBα、PCNA及TNFα蛋白表达变化。 6.免疫荧光检测培养细胞NF-κBp65核转位情况。 7.EMSA检测NF-κB-DNA结合活性。 8.特异性荧光底物反应检测蛋白酶体活性20s亚基活性。 9.ELISA方法检测各组兔血清和细胞培养上清中炎症因子IL-6、TNFα浓度。 结果： 1.结扎新西兰白兔左肾动脉分支并切除右肾的方法建立了慢性肾衰竭动脉粥样硬化的模型：模型组兔术后出现明显的蛋白尿和血尿，并逐渐出现贫血；出现明显的高血压；血清BUN、SCr逐渐升高；肾脏病理出现明显的肾小球硬化和肾间质纤维化。兔主动脉逐渐出现脂纹、粥样斑块等动脉粥样硬化早中期的变化。使用MG132和PDTC干预后能明显减轻主动脉动脉粥样硬化的病理变化。 2.慢性肾衰竭兔主动脉NF-κB信号通路组分表达及MG132和PDTC干预的效果：与Sham相比，NF-κBmRNA和蛋白水平表达均增加，NF-κB-DNA结合活性明显增强，随病程延长更为明显。其抑制因子IκBα mRNA和蛋白水平表达和NF-κB呈现相反的变化。MG132干预后能使NF-κBmRNA和蛋白水平表达降低；NF-κB-DNA结合活性明显下降；IκBα mRNA和蛋白水平表达上调。PDTC干预后和MG132作用类似，证实慢性肾衰竭兔主动脉内存在NF-κB信号通路的活化。 3.慢性肾衰竭兔主动脉泛素-蛋白酶体信号通路组分表达及MG132和PDTC的干预作用：与Sham组相比，慢性肾衰竭兔主动脉中Ub mRNA表达逐渐上调、泛素化蛋白表达未见明显变化：E1 mRNA和蛋白表达逐渐增加；蛋白酶体活性明显增强，且随病程进展更为明显。MG132干预后，Ub mRNA表达下调，泛素化蛋白表达增加，E1 mRNA和蛋白表达下降；蛋白酶体活性下降。证实慢性肾衰竭兔主动脉内存在泛素蛋白酶体通路的活化。与MG132相比，PDTC干预后对Ub mRNA和ElmRNA和蛋白表达与MG132相仿，但对蛋白酶体活性影响较小，对泛素化蛋白表达无影响。 4.慢性肾衰兔血清中的炎症因子TNFα、IL-6浓度和兔主动脉中TNFα的表达变化及MG132和PDTC的干预作用：与对照组相比，血清中的炎症因子TNFα、IL-6浓度逐渐升高，主动脉中TNFα的表达逐渐增加。MG132和PDTC干预后均能降低血清中的炎症因子TNFα、IL-6浓度和主动脉中TNFα的表达。证实慢性肾衰竭兔存在全身和主动脉局部的微炎症反应。 5.慢性肾衰血清在较低浓度时(3％～10％)时呈浓度和时间依赖性促进内皮细胞和平滑肌细胞的增殖，较高浓度时(>10％)，促增殖作用减弱，促细胞凋亡增强。MG132和PDTC均能抑制10％慢性肾衰血清诱导的内皮细胞和平滑肌细胞增殖。 6.与正常血清相比，10％慢性肾衰血清能使内皮细胞和平滑肌细胞NF-κB mRNA和蛋白表达增加，IκBα mRNA和蛋白表达降低；10％慢性肾衰血清能使NF-κBp65发生核转位；不同浓度慢性肾衰血清(3％～10％)使内皮细胞和平滑肌细胞NF-κB DNA结合活性呈浓度依赖性增加，10％慢性肾衰血清使内皮细胞和平滑肌细胞NF-κB DNA结合活性24h持续增加。MG132和PDTC干预后，能抑制10％慢性肾衰血清刺激的内皮细胞和平滑肌细胞NF-κBmRNA和蛋白的表达，增加IκBα mRNA和蛋白表达，抑制NF-κB DNA结合活性。 7.10％1熳性肾衰血清使主动脉内皮细胞和平滑肌细胞培养上清IL-6和TNFα含量明显增加，刺激6小时后升高幅度最为明显，以后仍缓慢上升。同时内皮细胞和平滑肌细胞内TNFα蛋白表达也较对照明显增加。MG132和PDTC干预后，均能降低细胞炎症因子TNFα、IL-6的分泌和主动脉中TNFα的表达。 8.10％慢性肾衰血清刺激后，主动脉内皮细胞和平滑肌细胞Ub和ElmRNA的表达上调，E1蛋白的表达增加，蛋白酶体活性较对照组明显升高。MG132干预后，能抑制主动脉内皮细胞和平滑肌细胞Ub和ElmRNA的表达，降低El蛋白的表达，抑制蛋白酶体活性。与MG132相比，PDTC干预后对细胞Ub mRNA和ElmRNA和蛋白表达与MG132相仿，但对蛋白酶体活性影响较小。 结论： 1、慢性肾衰竭兔随病程的进展主动脉逐渐出现动脉粥样硬化的病理改变。 2、慢性肾衰兔主动脉内存在NF-κB信号通路的活化和炎症细胞因子的表达，并随慢性肾衰病程进展呈现出加重的趋势。 3、慢性肾衰兔主动脉内存在泛素-蛋白酶体信号通路的活化，阻断泛素一蛋白酶体途径可显著抑制慢性。肾衰兔主动脉NF-κB信号通路的活化和炎症细胞因子的表达；明显减轻兔主动脉粥样硬化的病理改变。 4、较低浓度的慢性肾衰兔血清(≤10％)能促进兔主动脉内皮细胞和平滑肌细胞异常增殖，呈一定浓度和时间依赖性；而高浓度的慢性肾衰兔血清对兔主动脉内皮细胞和平滑肌细胞增殖作用减弱，促凋亡作用增强。 5、较低浓度的慢性肾衰兔血清(≤10％)能使兔主动脉内皮细胞和平滑肌细胞NF-κB信号通路的活化和炎症细胞因子的表达，呈一定的浓度和时间依赖性。 6、较低浓度的慢性肾衰兔血清(≤10％)能使兔主动脉内皮细胞和平滑肌细胞泛素-蛋白酶体途径明显活化；阻断泛素-蛋白酶体途径可显著抑制慢性肾衰兔主动脉内皮细胞和平滑肌细胞NF-κB信号通路的活化和炎症细胞因子的表达，抑制细胞的炎症增殖反应。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写一览表

声明

前 言

第一部分阻断泛素-NF-κB通路对慢性肾衰兔主动脉粥样硬化的防治作用

分题一慢性肾衰兔动脉粥样硬化模型的建立

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

分题二 慢性肾衰竭兔主动脉泛素-NF-κB信号通路动态变化

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

分题三 阻断泛素-NF—κB通路对慢性肾衰兔主动脉粥样硬化的影响

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第一部分照片

参考文献

第二部分 阻断泛素-NF-κB通路对慢性肾衰血清诱导主动脉内皮细胞活化的调控作用

分题一慢性肾衰血清对兔主动脉内皮细胞增殖、凋亡及NF—κB信号通路的影响

材料和方法

结 果

讨 论

小 结

分题二阻断泛素-NF-κB通路对慢性肾衰血清诱导内皮细胞活化的影响

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第二部分照片

参考文献

第三部分 阻断泛素-NF-κB通路对慢性肾衰血清诱导主动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用

分题一慢性肾衰血清对兔主动脉平滑肌细胞增殖及NF-κB信号通路的影响

材料和方法

结 果

讨 论

小 结

分题二阻断泛素-NF-κB通路对慢性肾衰血清诱导平滑肌细胞增殖的影响

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第三部分照片

参考文献

全文结论

致 谢

文献综述一核因子-κB与动脉粥样硬化的关系

文献综述二泛素-蛋白酶体途径与肾脏疾病

攻读博士学位期间发表的论文

英文论著