基于量子点和免疫磁珠技术同步检测抗弓形虫IgG和IgM抗体的实验研究

摘要

弓形虫病是一种严重危害人类健康和影响优生优育的人畜共患疾病。ELISA法是目前诊断弓形虫感染的常规检测方法，主要是通过检测特异性IgG(免疫力水平指标)和IgM(近期感染指标)抗体的有无来判断机体的感染情况，但该方法存在不能同步检测IgG和IgM抗体，检测时间长，耗费试剂多，操作繁琐等缺点。 量子点是一种新型荧光标记材料，与传统荧光染料相比具有以下优点：激发波长范围较宽，同一波长的光能激发不同大小的量子点；发射波长窄而对称，同时使用具有不同光谱特征的量子点时，发射光谱间重叠较少；不同粒径和组成的量子点其发射波长不同。因此，应用不同发射波长的量子点对不同的待检分析物同时进行标记，可以达到多个指标同时检测的目的。 本研究将量子点标记技术与免疫磁珠技术相结合，研制了一种可同步检测抗弓形虫IgG和IgM抗体的检测体系，本方法不仅操作简便快速，还具有较高的特异性和敏感性，可用于弓形虫感染的筛查。 方法： 1.抗原固化磁性微球 采用碳二亚胺交联法将弓形虫重组抗原固化在羧基磁性微球表面。通过EDC和NHS溶液活化磁珠表面羧基后，活化的羧基再与抗原上的氨基进行反应，从而将弓形虫抗原固化在磁性微球表面，获得免疫磁珠。通过对磁性微球的粒径、EDC/NHS活化剂浓度等固化条件进行选择优化，建立稳定、高效的免疫磁性微球固化方法。 2.量子点标记二抗 采用碳二亚胺交联法将羧基化CdS/ZnS量子点与抗体进行标记.分别以发射波长为580nm、618nm的量子点分别标记羊抗人IgG和羊抗人IgM抗体，研究pH值，二抗加入浓度，反应时间对量子点发光的影响，制备适用于抗弓形虫IgG和IgM抗体同步检测体系的量子点标记二抗试剂。 3.分别建立抗弓形虫IgG、IgM抗体检测方法 以固化了弓形虫抗原的磁性微球作为固相载体，量子点标记二抗作为检测抗体，采用间接法原理，分别建立抗弓形虫IgG和IgM抗体的检测方法，并对检测条件进行优化。分别检测人抗弓形虫IgG、IgM标准品，观察本方法的线性范围、灵敏度、重复性和准确度。收集临床标本，分别用本方法与进口ELISA试剂盒进行检测并对结果进行比较，观察两种检测方法的结果有无统计学差异。 4.抗弓形虫IgG和IgM抗体同步检测体系的构建 在已建立的单个抗体检测方法的基础上，对关键检测条件进行统一和优化，构建抗弓形虫IgG和IgM抗体同步检测体系。同步检测人抗弓形虫IgG、IgM标准品，观察该体系的线性范围、灵敏度、重复性和准确度。用已构建的同步检测体系对280例临床标本进行同步检测，并将结果与进口ELISA试剂盒进行比较，探讨多指标同步检测的可行性。 主要结果： 一、方法学建立 (1)抗原固化磁性微球 选择粒径为3μm的羧基磁性微球作为固相载体，加入EDC(6mg/ml)和NHS(4mg/ml)溶液进行活化，弓形虫抗原的最适固化浓度为50μg/mL，固化效率为54.2％。 (2)量子点标记二抗 实验结果表明，量子点标记二抗的最适反应pH值为6.0，羊抗人IgG、IgM抗体的最适标记浓度分别为40μg/mL、50μg/mL。 (3)抗弓形虫IgG、IgM抗体检测方法的建立 分别建立了抗弓形虫IgG和IgM抗体检测方法，经过实验优化，量子点羊抗人IgG、IgM的最适工作浓度分别为1:50、I:100，待测血清最适稀释度均为1:100。通过检测200例健康人血清样本确定了抗弓形虫IgG抗体和IgM抗体Cutoff值分别为：0.45、0.44。 (4)同步检测抗弓形虫IgG和IgM抗体检测体系的建立 同步检测抗弓形虫IgG和IgM抗体，量子点标记羊抗人IgG、IgM的最适工作浓度分别为1:200、1:100，待测血清最适稀释度为1:100。检测200例健康人血清样本确定了抗弓形虫IgG抗体和IgM抗体Cutoff值分别为：0.55、0.51。同步检测抗弓形虫IgG和IgM抗体两个指标，仅需30min就可完成整个检测过程，而常规ELISA方法一次只能检测单个指标，完成两个指标的检测往往需要4h。 二、方法学评价 (1)抗弓形虫IgG、IgM抗体检测方法的方法学评价 按已建立的方法分别检测人抗弓形虫IgG、IgM标准品，其最低检测限分别为：3.04IU/ml、3.11 IU/ml。批内重复性实验平均CV分别5.2％、5.4％，天间重复性实验平均CV分别为6.5％，6.6％。准确性实验偏倚系数分别为：6.0％，6.3％。20例其它TORCH系列阳性血清标本与本方法均无交叉反应。阻断实验结果显示，弓形虫IgG和IgM抗体的阻断率均在50％以上。 (2)同步检测抗弓形虫IgG、IgM抗体检测体系的方法学评价 同步检测人抗弓形虫IgG和IgM标准品，其最低检测限分别为：4.211U/ml、4.321U/ml；批内重复性实验平均CV分别为：6.0％、6.2％；天间重复性实验平均CV为7.2％、7.4％；准确性实验偏倚系数分别为：7.6％，7.2％。 三、方法学比较 (1)抗弓形虫IgG、IgM抗体检测方法的方法学评价 收集临床标本，用已建立的抗弓形虫IgG、IgM抗体检测方法分别进行检测，并与进口ELISA试剂盒检测结果比较。抗弓形虫IgG和IgM抗体检测结果的符合率分别为：96.5％、96.8％，采用SPSS10.0软件对数据进行配对X2检验分析，P值均>0.05，认为两种方法分别检测抗弓形虫IgG和IgM抗体的测定结果无显著性差异。 (2)同步检测抗弓形虫IgG和IgM抗体检测体系的方法学评价 收集临床标本，用已构建的抗弓形虫IgG、IgM抗体同步检测体系进行同步检测，并与进口ELISA试剂盒检测结果比较。弓形虫IgG和IgM抗体检测结果的符合率分别为：96.4％，97.1％，采用SPSS10.0软件对数据进行配对X2检验分析，P值均>0.05，认为本方法同步检测抗弓形虫IgG和IgM抗体的测定结果与ELISA法无显著性差异。 结论： 1.以磁性微球作为固相载体，在其表面成功固化了弓形虫重组抗原，固化效率最高可达54.2％。利用磁珠可快速富集的特性，在加快了检测速度同时，也极大的提高了检测灵敏度。本法同步检测抗弓形虫IgG和IgM抗体仅需30 min，较ELISA法的2.5h明显加快。 2.建立的抗弓形虫IgG、IgM抗体单指标检测方法，其灵敏度、检测范围、重复性、稳定性等达到临床初步应用的要求，为同步检测体系的建立奠定了基础。 3.选用不同发射波长的量子点分别标记不同二抗，经同一激发光激发，发射两种不同波长的光，实现了多指标的同步检测，为基于量子点标记同步检测更多抗体提供了技术支持。 4.构建的抗弓形虫IgG和IgM抗体同步检测体系，具有特异性较好、速度快、操作简便、灵敏度高等优点，为简化操作步骤、缩短报告时间创造了条件，也为进一步研制TORCH感染多种病原体的同步检测提供了一种新的技术手段。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩写一览表

声明

前 言

第一部分 抗弓形虫IgG、IgM抗体单指标检测方法的建立

实验一 弓形虫抗原固化磁性微球的实验研究

材料与方法

结 果

讨 论

实验二 量子点标记二抗的实验研究

材料与方法

结 果

讨 论

实验三 抗弓形虫IgG抗体检测方法的建立及优化

材料与方法

结 果

实验四 抗弓形虫IgM抗体检测方法的建立及优化

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第二部分 抗弓形虫IgG和IgM抗体同步检测体系的建立及初步应用

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

全文结论

致 谢

参考文献

文献综述 量子点在标记免疫分析中的发展与应用

攻读硕士学位期间撰写的文章