薄荷醇通过影响皮肤KC内PLC活性而产生促透作用的研究

摘要

目的:
　　从细胞和分子水平探讨薄荷醇对体外培养皮肤角质形成细胞(KC)中磷脂酶C(PLC)活性的影响,找出KC内Ca2+的变化与皮肤结构改变的关系,较系统地探讨薄荷醇的促透作用机制,为确立中药促透剂薄荷醇在药剂学中的应用提供较充分的科学依据。
　　方法:
　　1.体外皮肤渗透性实验
　　采用改良的Franz扩散池,选用家兔背部皮肤,以对乙酰氨基酚作为模型药物进行体外皮肤渗透性实验,计算出各组的累积渗透量、稳态流量和滞留时间,比较薄荷醇等促透剂对对乙酰氨基酚经皮吸收的效果。
　　2.Ca2+含量检测实验
　　体外培养KC,实验细胞分为空白组、1‰DMSO组、50μM、100μM、200μM薄荷醇组、200μM薄荷醇+U73122组、U73122组、200μM薄荷醇+硝苯地平组和硝苯地平组。根据分组加入培养基,利用流式细胞仪结合Fluo-3/AM染色技术,半定量检测各组KC内的Ca2+浓度。
　　3.磷脂酶C(PLC)活性检测实验
　　体外培养KC,实验细胞分为空白组、1‰DMSO组、50μM、100μM、200μM薄荷醇组、200μM薄荷醇+U73122组和U73122组。根据分组加入培养基4h后,裂解,离心,收集上清液,用人PLC酶联免疫分析试剂盒进行检测各组的PLC活性;用含200μM薄荷醇培养基培养细胞4h后,换入正常培养基,分别收集0、2、4、8、12、24h的细胞,同法检测不同时间KC的PLC活性。
　　4.Ca2+-ATP酶活性检测实验
　　体外培养KC,实验细胞分为空白组、1‰DMSO组、50μM、100μM、200μM薄荷醇组、200μM薄荷醇+U73122组和U73122组。根据分组给药4h后,破碎细胞,收集上清液,用超微量Ca2+-ATP酶试剂盒检测各组KC的Ca2+-ATP酶活性。
　　5.ATP含量检测实验
　　体外培养KC,实验细胞分为空白组、1‰DMSO组、50μM、100μM、200μM薄荷醇组、200μM薄荷醇+U73122组和U73122组。根据分组给药4h后,破碎细胞,收集上清液,用ATP含量试剂盒检测各组KC的ATP含量。
　　6.蛋白激酶C(PKC)活性检测实验
　　体外培养KC,实验细胞分为空白组、1‰DMSO组、50μM、100μM、200μM薄荷醇组、200μM薄荷醇+U73122组、U73122组、200μM薄荷醇+白屈菜红碱组和白屈菜红碱组。根据分组加入培养基4h后,裂解,收集上清液,用人PKC酶联免疫分析试剂盒进行检测各组的PKC活性;用含200μM薄荷醇培养基培养细胞4h后,换入正常培养基,分别收集0、2、4、8、12、24h的细胞,同法检测不同时间KC的PKC活性。
　　7.细胞膜流动性检测实验
　　体外培养KC,实验细胞分为空白组、1‰DMSO组、50μM、100μM、200μM薄荷醇组、200μM薄荷醇+白屈菜红碱组和白屈菜红碱组。根据分组加入培养基4h后,收集细胞,加入1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH)负载液,避光37℃孵育30min后,用带偏振装置的荧光分光光度计检测各组细胞膜的荧光强度(激发波长362nm,发射波长432nm),并计算得出各组的荧光偏振度和微粘度。
　　8.考马斯亮蓝染色实验
　　接种KC于预置玻片的六孔板中,贴壁后分为空白组、1‰DMSO组、200μM薄荷醇组、200μM薄荷醇+白屈菜红碱组和白屈菜红碱组。采用考马斯亮蓝染色方法,显微镜观察各组KC的微丝骨架结构变化。
　　结果:
　　1.不同促透剂对皮肤渗透性的影响
　　体外促透实验结果显示,与空白组相比,丙二醇组累积渗透量无显著性差异(p>0.05),樟脑组的累积渗透量有所增加(p<0.05),氮酮组、薄荷醇组和油酸组的累积渗透量明显增加(p<0.01);与氮酮组相比,薄荷醇组累积渗透量较大(p<0.05),油酸组累积渗透量无显著性差异(p>0.05),丙二醇组和樟脑组累积渗透量较小(p<0.01)。与空白组相比,丙二醇组稳态流量无显著性差异(p>0.05),樟脑组的稳态流量有所增加(p<0.05),氮酮组、薄荷醇组和油酸组的稳态流量明显增加(p<0.01);与氮酮组相比,油酸组的稳态流量无显著性差异(p>0.05),薄荷醇组的稳态流量较大(p<0.05),丙二醇组和樟脑组的累积渗透量较小(p<0.01)。与空白组相比,氮酮组、薄荷醇组和丙二醇组的滞留时间无显著性差异(p>0.05),樟脑组的滞留时间有所缩短(p<0.05),油酸组的滞留时间明显增加(p<0.01);与氮酮组相比,薄荷醇组和樟脑组的滞留时间无显著性差异(p>0.05),油酸组的滞留时间明显较长(p<0.01),丙二醇组的滞留时间较长(p<0.05)。
　　2.薄荷醇对KC内Ca2+水平的影响
　　流式细胞仪结果显示,与空白组相比,DMSO组、U73122组和硝苯地平组的荧光强度无显著性差异(p>0.05),荧光强度随薄荷醇浓度而增加(p<0.01);薄荷醇+U73122组和薄荷醇+硝苯地平组的荧光强度虽低于同浓度的薄荷醇组(p<0.01),但仍高于空白组(p<0.01)。
　　3.薄荷醇对KC的PLC活性的影响
　　PLC活性检测实验显示,与空白组相比,DMSO组PLC活性无显著变化(P>0.05),U73122组的PLC活性明显降低(P<0.01),KC的PLC活性随薄荷醇浓度的增大而增加(P<0.01);薄荷醇+U73122组的PLC活性与同浓度的薄荷醇组相比明显降低(P<0.01)且与空白组无显著性差异(P>0.05)。200μM薄荷醇组换入正常培养基后,PLC活性随时间缓慢恢复正常水平。
　　4.薄荷醇对KC内Ca2+-ATP酶活性的影响
　　Ca2+-ATP酶活性检测实验显示,与空白组相比,DMSO组的Ca2+-ATP酶活性有所降低(P<0.05),U73122组的Ca2+-ATP酶活性有所增加(P<0.05),Ca2+-ATP酶活性随薄荷醇浓度的增大而降低(P<0.01);薄荷醇+U73122组的Ca2+-ATP酶活性与同浓度的薄荷醇组相比虽有所增加(P<0.05),但仍低于空白组(P<0.01)。
　　5.薄荷醇对KC内ATP含量的影响
　　ATP含量检测实验显示,与空白组相比,DMSO组的ATP含量无显著变化(P>0.05),U73122组的ATP含量有所增加(P<0.05),ATP含量随薄荷醇浓度的增大而减少(P<0.01);薄荷醇+U73122组的ATP含量与同浓度的薄荷醇组相比有所增加(P<0.05),但仍低于空白组(P<0.01)。
　　6.薄荷醇对KC的PKC的影响
　　PKC活性检测实验显示,与空白组相比,DMSO组的PKC活性无显著变化(P>0.05),U73122组的PKC活性有所降低(P<0.05),白屈菜红碱组的PKC
　　活性明显降低(P<0.01),KC的PKC活性随薄荷醇浓度的增大而增加(P<0.01);薄荷醇+U73122组和薄荷醇+白屈菜红碱组的PKC活性与同浓度的薄荷醇组相
　　比明显降低(P<0.01)但明显高于空白组(P<0.01)。200μM薄荷醇组换入正常培养基后,PKC活性随时间缓慢恢复正常水平。
　　7.薄荷醇对KC膜流动性的影响
　　膜流动性实验结果显示,与空白组相比,DMSO组和白屈菜红碱组的荧光偏振度无显著变化(P>0.05),50μM薄荷醇组的荧光偏振度有所减小(P<0.05),100μM、200μM薄荷醇组和薄荷醇+白屈菜红碱组荧光偏振度明显减小(P<0.01);薄荷醇+白屈菜红碱组的荧光偏振度与同浓度的薄荷醇组相比较小(P<0.05);与空白组相比,DMSO组和白屈菜红碱组的微粘度无显著性差异(P>0.05)。各薄荷醇组的微粘度明显减小(P<0.01)。薄荷醇+白屈菜红碱组的微粘度与同浓度的薄荷醇组相比较小(P<0.05)。
　　8.薄荷醇对KC微丝骨架结构的影响
　　考马斯亮蓝染色结果显示,空白组可清楚看见细胞质内骨架蛋白显蓝色,细胞核染色较致密,细胞形态不规则。细胞间无重叠,相邻细胞之间有密集的骨架束相互穿行。与空白组相比,DMSO组以及白屈菜红碱组的细胞骨架没有明显的变化。与空白组相比,薄荷醇组细胞体积缩小,细胞连接明显减少,细胞间隙明显增宽,细胞间紧密连接程度下降。与薄荷醇组相比,薄荷醇+白屈菜红碱组的细胞连接较多,细胞间隙缩小,细胞间连接程度增加,但与空白组比仍有一定的差异。
　　结论:
　　1.不同促透剂即使浓度相同但对同一药物的经皮吸收有不同的促透效果。
　　2.薄荷醇可以通过增加PLC的活性,激活KC内钙通道使Ca2+浓度增加而发挥促透作用。
　　3.薄荷醇可以通过增加PLC的活性,使KC的Ca2+-ATP酶活性降低,间接增加KC内的Ca2+浓度。
　　4.薄荷醇可以使KC内的ATP含量明显降低,PLC活性变化对其有一定的影响。
　　5.薄荷醇可以通过增加PLC的活性使KC内PKC的活性也有所增加。
　　6.薄荷醇可以增加KC的细胞膜流动性,而PKC起负调节作用。
　　7.薄荷醇可以改变KC的微丝骨架结构,细胞体积缩小,细胞间隙增大,该作用机制可能与PKC的活性变化有关。

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声明

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中文摘要

英文摘要

序言

1. 研究背景

2. 研究的创新点

3. 研究意义

实验部分

1 实验材料

1.1 实验动物

1.2 药物与试剂

1.3 主要仪器

1.4 药物与试剂配制

2 实验方法

2.1 体外皮肤渗透性实验

2.2 KC的原代培养[29, 42]

2.3 Ca2+含量检测实验

2.4 PLC活性检测实验

2.5 Ca2+-ATP 酶活性检测实验

2.6 ATP含量检测实验

2.7 PKC活性检测实验

2.8 细胞膜流动性检测实验

2.9 考马斯亮蓝染色实验

2.10 统计学方法

3 实验结果

3.1 体外皮肤渗透性实验

3.2 Ca2+含量检测实验

3.3 PLC活性检测实验

3.4 Ca2+-ATP 酶活性检测实验

3.5 ATP含量检测实验

3.6 PKC活性检测实验

3.7细胞膜流动性检测实验

3.8考马斯亮蓝染色实验

4讨论

5 结论

参考文献

综述

致谢

附录一 英文缩略表

附录二 在读硕士期间的科研情况