慢病毒载体介导的versicanRNAi对毛乳头细胞凝集性生长影响的研究*

摘要

背景：
　　 毛囊是皮肤的重要附属器，对于研究真表皮间的信号交换、伤口愈合和组织工程皮肤具有重要的生物学意义。位于毛囊基底部的毛乳头细胞(DPCs)，作为毛囊组成的重要细胞，其凝集性生长是从胚胎毛囊发育过程中保留下来的一个重要特征，表现为细胞融合前呈多层聚集性生长，周围细胞呈放射状排列。因与诱导毛囊形成的能力密切有关，DPCs已成为研究毛囊发育、再生的重要对象。多能蛋白聚糖(versican)是一种大分子硫酸软骨素蛋白聚糖，为DPCs细胞外基质的主要组成成份之一，其生物学功能是作为分子信号与水化分子，在细胞粘附、迁移和分化中发挥重要作用。我们在前期的实验中发现，随着培养代次的增加，DPCs的凝集性生长逐渐消失，versican基因及蛋白的表达也随之降低，表明versican基因的表达与DPCs凝集性生长密切相关。因此，DPCs凝集性生长与versican基因表达之间是否存在因果关系，是我们需要进一步研究的重要内容。这对于研究DPCs的凝集性生长和诱导毛囊形成的机制，阐明毛囊形态发生和组织工程皮肤中毛囊重建等都具有十分重要的科学意义。
　　 目的：
　　 1.分离纯化得到DPCs，诱导高代(第8代)DPCs重新出现凝集性生长。
　　 2.构建versican RNAi的慢病毒载体。
　　 3.用构建好的versican RNAi慢病毒载体感染低代(第2代)DPCs，观察versican基因敲减后对DPCs凝集性生长的影响。
　　 方法：
　　 1.采用我科建立的“二步酶消化法”分离培养正常人DPCs，观察体外培养条件下DPCs形态和生长情况，并行α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)免疫染色鉴定。
　　 2.采用DMEM完全培养基加原代DPCs回收培养基，按1:1的比例培养第8代DPCs，诱导其重新出现凝集性生长现象的可行性；并行MTT、RT-PCR、western-blotting等方法检测versican表达情况。
　　 3.设计4种versican基因RNAi的靶点，经酶切后与慢病毒载体相连，转入293T细胞中进行小量扩增，并在靶细胞H1299中应用qPCR和western-blotting方法筛选出最佳靶点，再大量扩增，用于后续实验。
　　 4.用筛选出的有versican基因RNAi的最佳靶点的慢病毒载体感染低代(第2代)DPCs，通过MTT、qPCR和western-blotting、镜下观察等方法观察versican基因敲减对DPCs凝集性生长的影响。
　　 结果：
　　 1.采用我科建立的“二步酶消化法”分离培养了正常人DPCs，单个细胞的形态呈梭形，形态上类似成纤维细胞，但体积较大，具有明显的多层凝集性生长特性，体外培养的DPCs表达特异性标记物α-SMA。
　　 2.用DMEM完全培养基加原代DPCs培养时回收的培养基，按1:1的比例培养第8代DPCs，约3天左右，出现细胞的聚集性生长，约7天左右开始出现细胞凝集性生长的情况，细胞凝集成团，呈多层放射状生长。通过MTT检测发现第2代DPCs的增殖能力较第8代DPCs和成纤维细胞强(p<0.01)，RT-PCR和western-blotting检测发现第8代非凝集性生长、经新鲜的原代培养基回收液诱导、重新形成了凝集性生长的DPCs与呈凝集性生长的第2代的DPCs，其mRNA和蛋白的表达明显高于非凝集性生长的第8代DPCs和成纤维细胞(p<0.01)。
　　 3.构建四个versican RNAi靶点，在靶细胞H1299中经qPCR和western-blotting对目的基因进行筛选发现，4个靶点对versican基因及蛋白表达均有显著敲减作用，效率均达到70％以上；2＃、3＃靶点敲减效率高达90％以上，其中尤以2＃靶点敲减效率最高，故将2＃确定为最佳靶点。
　　 4.用筛选出的有versican基因RNAi的最佳靶点--2＃靶点的慢病毒载体感染低代(第2代)DPCs，荧光显微镜下观察GFP的表达情况，可见强绿色的荧光颗粒，转染效率达80～90％，细胞边缘模糊，折光度明显降低，形态略显老化；qPCR及western-blotting检测versican mRNA及蛋白的表达发现，versican mRNA及蛋白的表达均低于阴性对照组、空白对照组和成纤维细胞对照组(p<0.01)，而其余几组比较则无显著性差异；用MTT检测发现感染病毒载体的DPCs的增殖能力明显低于未感染病毒的DPCs，特别是在第三天以后，差异更加显著(p<0.01)。
　　 结论：
　　 1.成功诱导了高代(第8代)DPCs重新出现了凝集性生长，其versican基因及蛋白表达增高。这说明DPCs凝集性生长时较非凝集性生长时，versican的表达要强。
　　 2.成功构建了versican RNAi的慢病毒载体，经qPCR及western-blotting检测，干扰效果高达90％以上。
　　 3.低代(第2代)DPCs的versican行RNAi后，细胞的增殖能力明显降低、细胞的形态老化，不再出现凝集性生长的现象。这证明versican是决定DPCs凝集性生长的重要基因。