FXR对肝型脂肪酸结合蛋白表达的影响及其机制的初步研究

摘要

研究背景:非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver,NAFL)是一种非过量饮酒所致的,以肝细胞脂肪变性和脂质贮积为特征的临床病理综合征,其中肝脂肪酸代谢异常与NAFL发生发展密切相关,L-FABP是脂肪结合蛋白超家族的一员,在肝脏和小肠中高表达,调节着脂肪酸的摄取、转运、氧化以及酯化,近年来研究发现,L-FABP缺陷型小鼠能有效抵抗高脂饮食所诱导的脂肪肝,因而研究L-FABP对防治脂肪肝有重要意义。法尼酯X受体(farnesoid X receptor,FXR)是核受体超家族成员,通过调节诸多靶基因而在调控胆汁酸、脂类和葡萄糖的代谢过程中发挥着极其重要的作用,FXR的功能丧失与非酒精性脂肪肝密切相关。FXR和L-FABP主要在肝脏中表达,两者均与NAFL中有密切关系,那么研究FXR是否调控L-FABP的表达,将为进一步阐明二者在NAFL发生发展中的作用及为寻找防治NAFL的新靶点提供新的科学依据。
　　 研究目的:探讨FXR对L-FABP表达的影响及其调节的可能机制。
　　 研究方法:1.选取人胎肝细胞株L02和人肝癌细胞株HepG2为细胞模型,经FXR特异性激动剂CDCA或GW4064处理后,用逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)法和Western blotting免疫印迹法分别检测L-FABP在mRNA和蛋白水平的差异变化。2.用不同浓度的FXR激动剂CDCA(0mg/kg、10mg/kg、50mg/kg)灌胃C57BL/6小鼠7天后,取小鼠肝组织,采用半定量RT-PCR检测L-FABPmRNA表达水平,免疫组化和Western blotting免疫印迹法检测L-FABP蛋白表达变化。3.在线预测人L-FABP基因5'侧翼启动子区域存在FXR可能结合位点,DR9分值最高,为FXR的结合位点的可能性最大;提取HepG2细胞基因组DNA,PCR扩增包含DR-9的L-FABP基因启动子区,构建荧光素酶报告基因重组质粒pGL-2984/+128,以及构建不含DR9位点的pGL-2172/+11,利用脂质体,将其与FXR的表达质粒Vp-FXR共转染到HepG2细胞中,24小时后检测各组报告基因表达活性。
　　 研究结果:1.经FXR特异性激动剂GW4064或CDCA处理后,L02和HepG2细胞内的L-FABPmRNA和蛋白水平显著下降(p＜0.05)。2.动物在喂食含CDCA食物7天后,经RT-PCR测得L-FABPmRNA水平有明显下调;免疫组化结果显示:随着CDCA浓度的增加;L-FABP在肝脏组织的表达呈下降水平;Western blotting免疫印迹法结果表明:L-FABP蛋白表达与对照组相比也显著降低。3.在HepG2细胞中,共转染Vp-FXR可降低含DR9位点的pGL-2984/+128活性,但对不含DR9位点的pGL-2172/+11的活性无影响。
　　 研究结论:实验证实FXR激活后在体内外均可下调L-FABP的表达。因此,我们可以推测L-FABP是FXR作用于肝脏的新的靶基因。通过报告基因分析,FXR调控L-FABP的表达可能通过FXR的可能结合序列DR-9来实现的,但这一结论尚待进一步证实。以上有关研究,为深入认识FXR和L-FABP在脂肪酸代谢以及NAFL中的作用具有重要意义,二者有可能成为防治NAFL的新靶点。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略词表

前言

第一部分 FXR激活后可抑制L-FABP的表达

材料与方法

结果

讨论

小结

第二部分 FXR激动剂CDCA抑制C57BL/6小鼠肝脏L-FABP的表达

材料与方法

结果

讨论

小结

第三部分 FXR下调L-FABP基因表达机制的初步研究

材料与方法

结果

讨论

小结

全文总结

致谢

参考文献

文献综述 肝型脂肪酸结合蛋白的研究进展

攻读硕士学位期间发表的论文

附录:常用试剂的配制