FXR对apoM表达的影响及其机制的初步探讨

摘要

研究背景:
　　 动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是严重威胁人类健康的心脑血管疾病。体内脂代谢紊乱与动脉粥样硬化斑块的形成密切相关。类法尼醇X受体(famesoid X receptor,FXR)是孤儿核受体(orphan nuclear receptor)家族成员,是内源性胆汁酸(bile acids)的感应器(sensor),鹅脱氧胆汁酸(chenodexycholic acid,CDCA)为其最适天然配体。FXR通过调节诸多靶基因而调控脂类、胆固醇和葡萄糖的代谢,其在维持脂代谢平衡、胆汁酸代谢过程中发挥重要的调节作用。FXR与AS的发生密切相关。
　　 载脂蛋白(apolipoproteinM,apoM)是一种新近发现的载脂蛋白,它含有一个特征性的疏水结合盒。成熟的apoM保留了具有“疏水锚”作用的信号肽。研究发现apoM可能通过此信号肽锚着在高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)磷脂单层中,并且在HDL中含量极为丰富。研究结果表明apoM可通过影响胆固醇的逆向转运过程参与HDL的代谢过程,进而发挥重要的抗AS的功能。
　　 由于FXR和apoM均高表达于肝脏,且二者均与AS密切相关。那么apoM是否受FXR的调节?弄清该问题,对进一步阐明二者在AS发生发展中的作用,为防治AS的新靶点提供新的科学依据。
　　 研究目的:探讨FXR对apoM表达的影响及其调控的可能机制。
　　 研究方法:
　　 (1)选取肝癌细胞株HepG2和胎肝细胞株L02为细胞模型,经FXR激动剂(CDCA)处理细胞24h后,用RT-PCR法检测apoM表达的变化;经FXR激动剂(CDCA)处理细胞12h后,再用FXR的抑制剂(Guggulsterones)处理细胞24h,RT-PCR法检测apoM表达的变化。
　　 (2)选取肝癌细胞株HepG2为细胞模型,Western blotting免疫印迹法检测apoM蛋白表达的差异。
　　 (3)选取C57BL/6小鼠为动物模型,喂食CDCA后,RT-PCR法检测小鼠肝脏组织apoM mRNA表达的变化,Western blotting免疫印迹法检测小鼠肝脏组织apoM蛋白表达的差异。同时用免疫组化法检测小鼠肝、肾组织的表达。用匀相测定法检测小鼠血脂的变化。
　　 (4)通过生物信息学分析,在线预测人apoM基因5'侧翼启动子区域AGGTCAggAGTTCA存在FXR可能结合位点(DR2):提取HepG2细胞基因组DNA,PCR法扩增人apoM报告基因,构建重组质粒PGL3-basic/apoM(-1900～+165含DR2序列)和PGL3-basic/apoM(-1800～+165不含DR2序列)。脂质体法将vpFXR真核表达质粒瞬时共转染HepG2细胞,通过荧光素酶报告基因检测FXR对apoM启动子活性影响。
　　 研究结果:
　　 (1)在FXR激动剂(CDCA)处理的人肝癌细胞HepG2和胎肝细胞L02中,发现FXR显著下调apoM的表达(p＜0.05)。
　　 (2)在FXR活化后再用抑制剂(Guggulsterones)处理的人肝癌细胞HepG2和胎肝细胞L02中,发现FXR显著上调apoM的表达(p＜0.05)。
　　 (3)C57BL/6小鼠喂食含CDCA的食物,FXR活化后在体内可下调小鼠肝脏apoM的表达。
　　 (4)小鼠免疫组化结果显示:随着CDCA浓度的增加,小鼠肝脏和肾脏apoM的表达下降。
　　 (5)小鼠血脂测定结果显示:HDL和TC随CDCA浓度的升高而下降,LDL随CDCA浓度升高而升高,TG随着CDCA浓度的升高先升高再下降。
　　 (6)根据生物信息学分析人apoM基因转录起始位点上游3000bp区域,得出在-1863bp处存在可能FXR结合位点(DR2)。通过共转染实验结果显示:FXR可降低人apoM(-1900～+165)含有DR2序列启动子片段的转录活性,且下调幅度为对照的40％。而FXR对不含有DR2序列的人apoM(-1800～+165)启动子片段活性无影响。
　　 结论:
　　 (1)用FXR激动剂(CDCA)处理细胞后,发现FXR显著下调apoM的表达(p＜0.05)。
　　 (2)用FXR抑制剂(Guggulsterones)处理细胞后,发现FXR显著上调apoM的表达(p＜0.05)。
　　 (3)FXR活化后可下调小鼠体内apoM的表达。
　　 (4)通过共转染实验结果得出:FXR可能通过人apoM基因启动子特异结合序列(DR2)下调apoM基因表达。
　　 以上研究为初步探讨FxR和apoM在脂代谢以及AS等相关疾病中的作用提供了重要的实验依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略词表

前言

第一部分 FXR在细胞水平可以下调apoM基因的表达

材料与方法

结果

讨论

小结

第二部分 FXR在C57BL/6小鼠中可下调apoM的表达

材料与方法

结果

讨论

小结

第三部分 FXR下调apoM基因表达机制的初步研究

材料与方法

结果

讨论

小结

全文总结

致谢

参考文献

文献综述 载脂蛋白M的研究进展

攻读硕士学位期间发表的论文

附录:常用试剂的配制