基于肝素酶单克隆抗体的肿瘤分子显像及其抗肿瘤效应的实验研究

摘要

背景及目的：
　　 肿瘤转移是肿瘤患者死亡的主要原因，是制约临床治疗效果的一种恶性生物学行为。目前针对肿瘤早期转移的检测没有很好的方法，B 超、CT和MRI等是目前诊断肿瘤转移的重要手段，但只能对一定大小的转移瘤做出正确的诊断，且此时患者多发生转移，失去了手术治疗的最佳时机。因此，寻找能够早期诊断肿瘤转移的技术日益重要。
　　 近年来，分子影像学(Molecular Imaging)的发展为肿瘤的早期诊断及治疗开辟了新的领域。磁共振(MR)分子成像是分子影像学的重要领域之一，超顺磁性分子探针的出现使其作为强大的信号扩增系统，大大提高了MR 检测靶向对比剂的敏感性。国内外已有研究者采用顺磁性离子复合物或磁性微粒结合单克隆抗体(mAbs)，选择性的改变肿瘤的弛豫时间。目前发现的肿瘤相关抗原多具有组织特异性，如AFP、PSA、CEA等，以这些抗原制备的抗体只适用于表达该类抗原的肿瘤分子影像诊断。因此寻找肿瘤组织共同、特异性的靶点一直是肿瘤分子显像的研究热点。
　　 肝素酶(Heparanase，Hpa)作为唯一能裂解细胞外基质(extracellular matrix，EMC)内蛋白聚糖主要成分硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulufate proteoglycans，HSPG)的内源性糖苷内切酶，在转移的恶性肿瘤中普遍存在，其表达水平的高低与肿瘤转移及病人的预后密切相关。我们过去的研究表明，肝素酶可以作为一种肿瘤共有抗原用于肿瘤的免疫治疗。那么，肝素酶是否可以作为一种肿瘤共有抗原用于肿瘤的分子影像诊断？
　　 基于以上分析，本研究在前期成功制备基于肝素酶全长Cdna 序列的单克隆抗体的基础上，采用分子影像学技术，以纳米金磁微粒(30nm)为分子显像对比剂，肝素酶单克隆抗体为靶向载体，构建HPA&GoldMag分子探针，用于体外、体内分子显像MR 研究，探讨其应用的可行性及其在肿瘤转移早期诊断中的意义。同时研究了肝素酶抗体体外抗肿瘤的生物效应，为肝素酶单克隆抗体在肿瘤分子影像诊断及其治疗中的作用于提供实验依据。
　　 研究方法：
　　 1、培养人肝癌HepG2、人胃癌SGC-7901、MKN45、人骨肉瘤U2OS、人乳腺癌MCF-7、人结肠癌SW480细胞株，采用Western blot技术，以HepG2、SGC-7901、MKN45、SW480、U2OS、MCF-7细胞总蛋白为样本，对已制备的7 号、11号、12号3株人肝素酶单克隆抗体进行初步鉴定，筛选出能够与肝素酶蛋白特异性结合的抗体，并采用免疫细胞化学技术进一步验证筛选出的抗体特异性。
　　 2、将纳米金磁微粒作为MR 成像的对比剂，用其标记筛选出的12 号肝素酶单克隆抗体构建特异性MR分子探针HPA&GoldMag，通过原子力显微镜观察纳米金磁微粒偶联抗体的能力，并通过细胞免疫荧光技术和流式细胞术等方法检测探针与上述肿瘤细胞结合的活性和特异性；分离新鲜白细胞，与未标记抗体和已标记抗体的金磁微粒共同孵育，模拟体内网状内皮系统吞噬金磁微粒，探讨影响白细胞吞噬金磁微粒的因素。
　　 3、应用3.0T 磁共振扫描仪并建立MR 扫描序列，观察不同浓度的纳米金磁微粒MR 成像情况，体外探讨探针应用于各种肿瘤细胞成像的可行性；建立荷瘤裸鼠模型，对荷瘤裸鼠经尾静脉注射HPA&GoldMag 探针，在注射前、注射后分别行MR 扫描，观察探针对肿瘤组织T2WI信号的影响，探讨其用于体内肿瘤MR 成像的可行性。
　　 4、通过Transwell 体外侵袭实验观察筛选出的肝素酶单克隆抗体对肿瘤转移的抑制作用，探讨其在体外对肿瘤细胞侵袭转移的抑制效果。
　　 结果：
　　 1、通过Western-blot技术和免疫细胞化学方法证实12 号肝素酶单克隆抗体与肝素酶蛋白结合的特异性最好。
　　 2、成功构建了HPA&GoldMag 特异性MR分子探针；原子力显微镜观察标记抗体前后的纳米金磁微粒，未标记抗体的纳米金磁微粒粒径大小约10个nm，标记抗体后金磁微粒的粒径变为20nm；激光共聚焦显微镜观察发现肝素酶阳性的HepG2、SGC-7901、MKN45、U2OS、SW480细胞株与HPA&GoldMag 特异性结合，均可见较强的红色荧光，而在肝素酶弱阳性的MCF-7细胞中红色荧光最弱，正常小鼠IgG对照组各细胞系均为阴性；白细胞吞噬实验的结果显示，其吞噬金磁微粒量的多少与吞噬细胞浓度成正相关，并随着吞噬细胞与金磁微粒共同孵育时间的增加其吞噬量随之增加，大约在3h 左右吞噬量接近饱和；白细胞对30-50nm大小的金磁微粒吞噬量统计学显示相差不大，P＞0.053、体外研究证实，HPA&GoldMag 探针与各肿瘤细胞共同孵育后行MR 扫描结果发现，探针可显著降低HepG2、SGC-7901、MKN45、SW480、U2OS细胞T2WI信号，略降低MCF-7细胞T2WI信号，而对HF细胞信号无显著影响，对照组正常小鼠IgG偶联的GoldMag对各肿瘤细胞MR信号均无显著影响。
　　 4、体内实验证实，在注射探针2 h后SGC-7901细胞荷瘤裸鼠肿瘤组织T2WI信号强度较注射探针前显著降低(p＜0.05)。
　　 5、Transwell 体外侵袭实验结果显示，12 号肝素酶单克隆抗体在100μg时作用于HepG2、SW480、SGC-7901、U2OS和MKN45细胞48小时后，其穿膜细胞数与正常小鼠IgG对照组相比明显减少(P＜0.05)，有统计学意义。
　　 结论：
　　 1、筛选鉴定的12 号肝素酶单克隆抗体可以与肝素酶蛋白特异性结合，采用纳米金磁标记肝素酶单克隆抗体成功构建成的HPA&GoldMag分子探针具有良好的理化性质和免疫活性，对体外多种肿瘤细胞及活体肿瘤组织具有特异靶向性，在3.0T 核磁共振扫描仪扫描下可以在T2W1明显降低肿瘤组织的信号强度，为下一步的采用肝素酶单克隆抗体进行肿瘤转移的分子影像研究奠定实验基础。
　　 2、体外研究亦证实，12 号肝素酶单克隆抗体具有明显的抑制肿瘤侵袭的能力。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写索引

声明

第一部份 磁性纳米微粒分子探针的构建及其在体内外MR 成像实验研究

第二部份 小鼠抗人肝素酶单克隆抗体体外抗肿瘤的实验研究

全文结论

致 谢

文献综述

硕士期间发表论文