过表达ANT1基因对颈总动脉球囊损伤SD大鼠血管内膜增生的影响及机制的研究

摘要

研究背景及目的：
　　 自上世纪70年代以来，包括经皮冠状动脉腔内成形术(Percutaneous coronaryintervention，PTCA)、经冠状动脉内旋切术、冠状动脉内支架植入术等技术在内的经皮冠状动脉介入治疗(Percutaneous coronary intervention，PCI)已经成为临床上治疗冠心病的主要手段，但术后再狭窄(Restenosis，RS)的高发生率严重影响了PCI手术效果。相关研究表明，使用PTCA和裸支架(Bare metal stent，BMS)植入术治疗冠心病，RS的发生率在20-30%以上[1]。虽然近年来药物洗脱支架(Drug eluting stent，DES)的应用以及术后药物支持治疗方法的进步使RS的发生率明显下降，但依然保持在5-10%左右，伴有糖尿病的患者则更高[2]。目前对于再狭窄发生发展机制的认识仍不明确。通常认为，PCI术后再狭窄主要是由于手术过程中血管内皮剥脱和血管内膜下出血激发的一系列炎症反应所导致。在血管损伤基础上，经过临床、生物学以及遗传学相关RS危险因素的影响，炎症反应激活，血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖和凋亡失衡，大量细胞外基质合成，最终导致内膜过度增生[3，4]。因此，研究促进VSMC凋亡和抑制损伤后血管VSMC过度增殖对防治再狭窄具有重要的意义。
　　 腺嘌呤核苷酸转位酶(Adenine nucleotide translocase，ANT)是一类位于线粒体内膜的跨膜蛋白，参与构成线粒体膜通道性转运孔(Mitochondrial permeability transitionpore，mPTP)。线粒体膜通透性转换孔持续开放，使线粒体功能失衡，线粒体膜电位(△ψm)降低，导致细胞凋亡。ANT的跨膜结构域分为基质构象(m-构象)和胞质构象(c-构象)两部分，两种构象可通过与ADP、ATP等底物结合而相互转换，而使mPTP开放或关闭。Shen[5]等在细胞凋亡模式生物秀丽线虫模型上研究发现WAN-1是调控细胞凋亡的关键基因，而WAN-1与哺乳动物的ANT-1同源。有研究表明过表达ANT1可以诱导心肌细胞和肿瘤细胞凋亡，甚至缩小肿瘤体积[6，7]。其作用机制可能与ANT1作为mPTP重要组成部分有关，引起线粒体膜电位降低，从而触发线粒体通路的细胞凋亡[8]。
　　 本实验室前期研究已证实在体外培养的血管平滑肌细胞过表达ANT1可以诱导其凋亡，其机制可能通过上调Bax表达，使Bax/Bcl-2比例继发升高有关[9]。因此，本课题利用分子克隆技术构建的携带有ANT1基因的重组腺病毒感染颈总动脉球囊损伤再狭窄SD大鼠模型，通过RT-PCR、Western-Blotting、免疫组化和TUNEL法原位末端标记技术检测过表达ANT1基因对再狭窄大鼠模型球囊损伤后颈总动脉VSMCs的影响和内膜的增生情况，探讨ANT1能否作为PCI术后再狭窄防治的新靶点。
　　 实验方法：
　　 1、实验采用的包含有ANT1基因的重组腺病毒由本实验室李燕硕士提供，滴度为2×1011PFU/ml，可以用动物载体转染。
　　 2、以健康雄性7周龄SD大鼠72只，体重280-300g，构建颈总动脉球囊损伤SD大鼠模型。分为假手术组、单纯球囊损伤组、Ad-ANT1腺病毒转染组和Ad-GFP空病毒转染组，每组18只。除假手术组外，其余三组在球囊损伤剥脱血管内皮后，分别向颈总动脉注入PBS缓冲液、Ad-GFP空载体腺病毒液和Ad-ANT1腺病毒液约40μl，作用30 min后，吸出病毒液，生理盐水冲洗管腔。
　　 3、分别在转染后7d、14d、28d麻醉处死各组SD大鼠模型，取损伤侧颈总动脉，剪取约0.5cm用于制作石蜡切片，HE染色评价血管内膜增生情况；TUNEL法检测颈总动脉细胞凋亡率；免疫组化检测Bax和Bcl-2表达情况。
　　 4、损伤侧颈总动脉除制作切片外的余下部分用于提取总RNA和总蛋白。利用RT-PCR和Western Blotting方法检测各实验组颈总动脉Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平。
　　 实验结果：
　　 1、成功构建颈总动脉球囊损伤血管再狭窄大鼠模型，可以用于后续实验。
　　 2、成功利用Ad-ANT1重组腺病毒载体将ANT1基因转染颈总动脉球囊损伤SD大鼠模型，RT-PCR显示Ad-ANT1转染组与Ad-GFP转染组和颈总动脉单纯损伤组比较，ANT1mRNA及蛋白的表达水平明显增高。
　　 3、颈总动脉血管内膜增生情况：Ad-ANT1转染组内膜/中膜面积比(IA/MA)与Ad-GFP转染组和颈总动脉单纯损伤组相比明显减小。
　　 4、颈总动脉细胞凋亡情况：TUNEL检测结果显示Ad-ANT1转染组与Ad-GFP转染组和颈总动脉单纯损伤组比较，平滑肌细胞凋亡率显著提高。
　　 5、免疫组化、RT-PCR和Western Blotting结果显示Ad-ANT1转染组与Ad-GFP转染组和颈总动脉单纯损伤组比较，Bax mRNA和蛋白表达水平明显提高，而Bcl-2mRNA和蛋白表达水平无显著差异。
　　 结论：
　　 1、颈总动脉球囊损伤后大鼠模型适合血管损伤后再狭窄内膜增生的分子机制的研究；
　　 2、本实验室构建的滴度在2×1011PFU/ml的Ad-ANT1重组腺病毒可以感染颈总动脉球囊损伤再狭窄大鼠模型并表达ANT1基因；
　　 3、过表达ANT1基因可以抑制颈总动脉损伤后内膜增生，其机制与上调促凋亡蛋白Bax表达促进新生内膜中VSMCs凋亡有关。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写一览

前 言

第一部分 大鼠颈总动脉球囊损伤后再狭窄模型的构建与重组腺病毒感染

材料和方法

结 果

讨 论

第二部分 过表达ANT1对颈动脉球囊损伤再狭窄大鼠模型平滑肌细胞和内膜增生的影响

材料与方法

结 果

讨 论

全文结论

致谢

参考文献

文献综述 PCI术后再狭窄发生机制及基因治疗研究进展

参考文献

硕士期间发表论文