特发性脊柱侧凸遗传流行病学调查及染色体19P13.3区域内候选易感基因SH3GL、CADD45B、FGF22外显子测序分析

摘要

研究背景及研究目的：
　　 特发性脊柱侧凸(Idiopathic Scoliosis简称IS)是一种以脊柱冠状面侧凸，伴椎体旋转的脊柱三维畸形。特发性脊柱侧凸病因不明，既往的研究集中在软骨、骨骼、关节、神经肌肉等组织学因素的致病机制上，但没有肯定的结果。近年的大量研究认为遗传因素在其发病中起重要作用，并表现出高度的遗传异质性，即在一些IS家系中存在主效基因，表现为常染色体显性遗传，而另一部分家系中没有主效基因，显示出多基因遗传的特征。常见报道有常染色体显性遗传模式，X连锁显性遗传模式，以及多基因遗传模式。
　　 我们采用遗传流行病学的方法，对在西南医院手术治疗的214例IS患者及其家系展开调查，通过年龄、发病率、家族聚集性、遗传度和各种遗传病的特点分析确定遗传因素的作用和遗传模式，取得肯定的结论。
　　 目前采用候选基因策略克隆法研究IS的易感基因有褪黑素受体1A基因，褪黑素受体1B基因，Matrilin-1(MATN1)基因，γ-1-syntrophin(SNTG1)基因，胶原COL1A1，胶原COL1A2、COL2A1、弹性纤维、原纤维蛋白，以及聚蛋白多糖等。这些结果都显示与IS有一定的相关性，但不能普遍适用于所有的IS患者。采用定位克隆策略研究结果显示IS易感基因的定位区域有：6p、10q、18q，6p、6q、17p11.2，8q，9q、16q，19p13，19p13.315q25-26，9q31.2，-9q34.2、17q25.3-qtel，12p，Xq23-26。虽然这些实验明确定位IS易感基因存在于染色体的特定区域，但这些区域内仍包含数以百万计的碱基对，存在成百上千的已知基因，具体哪个是IS的易感基因，还需要大量研究工作。到目前为止CHD7是唯一的通过定位克隆法研究定位的IS的易感基因。
　　 通过对定位克隆策略研究的文献复习，我们发现有2位学者将疾病基因位点定在19p13。Chan不仅定位在19p13.3内，还进一步的精确定位于D19S216标志附近，在D19S894～D19S1034之间，我们在Chan的研究结果的基础上做进一步的定位候选克隆法研究，经检索Human Genome Organisation(HUGO)所属的HUGO Gene Nomenclature Committee(HGNC)网站，2009年4月为止，在19P13.3区域内共有213个已知基因。我们在染色体19p13.3区域内，筛选出D19S216标志附近与组织结构、功能有关的SH3GL1，GADD45B，FGF22为IS候选基因，设计以家系为基础的“病例同胞对对照，病例亲属对对照”研究方案，并根据SH3GL1，GADD45B，FGF22基因的外显子设计引物对进行PCR扩增、克隆和测序，进行“同胞对、亲属对”之间的序列比对和蛋白质结构预测分析。
　　 研究方法：
　　 1.遗传流行病学调查：采用自行设计的IS遗传流行病学调查表，由经过培训的调查员对先证者家系进行调查，绘制家系谱。调查方法为门诊、病房面对面询问和电话询问相结合(先告知调查目的征得知情同意)。调查对象为AIS先证者、父亲和母亲。详细调查先证者的一级亲属有：先证者的同胞、双亲和先证者的子女；先证者的二级亲属有：先证者祖父母、外祖父母、姨、姑、舅和叔伯：三级亲属有：先证者的表兄妹、堂兄妹。流行病学常规调查内容有：一般情况、有无脊柱侧凸病史。对怀疑为易感者和AIS受累者的家系成员，需要行临床物理检查确定：包括脊柱视诊、Adam弯腰试验以及脊柱正位X线片检查。AIS的诊断标准：受试者直立冠状位X线片检查：如果Cobb角>10°为受累者，年龄小于14岁的表型正常的家系成员，统计时属于未发病的亲属。遗传流行病学的统计学分析：家族聚集性分析使用样本率与总体率比较U检验，AIS遗传度用Falconer回归法估算。
　　 2.定位候选克隆筛查易感基因，我们在染色体19p13.3区域内，筛选出D19S216标志附近与组织结构、功能有关的SH3GL1，GADD45B，FGF22为AIS候选基因，设计以家系为基础的“病例同胞对对照，病例亲属对对照”研究方案，并根据SH3GL1，GADD45B，FGF22基因的外显子设计引物对进行PCR扩增、克隆和测序，进行“同胞对、亲属对”之间的序列比对和蛋白质结构预测分析。
　　 研究结果：
　　 1、遗传流行病学的研究调查结果：成功设计AIS遗传流行病学调查表，对214个家系展开遗传流行病系统调查。数据统计结果：家系成员AIS发病年龄在3～20岁，78.91%在10～14岁之间，平均11.8岁。男：女=1:2.59，女性发病高于男性。调查家系总发病率11.74%。AIS-级亲属的发病率10.01%>二级亲属的发病率2.55%>三级亲属的发病率1.04%。用Falconer阈值法计算IS遗传度：AIS一级亲属遗传度h21为(77.68±10.39)%，二级亲属遗传度h22为(69.89±3.14)%，三级亲属遗传度h23为(62.14±11.92)%。一级、二级、三级亲属的遗传度h2的加权均值h21h22h23为(49.17±2.92)%。
　　 2、候选基因序列对比分析：候选基因SH3GL1，GADD45B，FGF22中的外显子成功克隆及扩增。SH3GL1基因包括10个外显子，各个外显子克隆序列比对分析可见56例患者及93例对照亲属SH3GL1基因均有突变位点，共发现12处等位基因存在变异，分别位于第2、4、5、6、8、10外显子处。其中10处变异均位于编码区，2处变异位点(均在第10外显子上)位于非编码区。GADD45B基因4个外显子的克隆序列比对分析发现2处等位基因存在变异，分别位于第3、4外显子处。FGF22基因3个外显子的克隆序列比对分析发现1处等位基因存在变异，分别位于第2、3外显子处。
　　 3、蛋白质序列预测分析93例亲属对照者中均为CC，56例先证者中有5例(8.93%)样本中等位基因为TT，他们的编码区mRNA序列与美国国立生物技术信息中心序列相同。样本为女性先证者和其母亲(IS患者)，女性先证者和其父亲(IS患者)，及一名男性先证者，其余51例(91.07%)为CC)，他们的SH3GL1的编码区mRNA序列与NCBI序列相比有差异。如果先证者基因在515位碱基由C突变为T，既CAG突变为TAG，则形成终止密码子(TAG)，蛋白阅读框发生改变。
　　 研究结论：
　　 1.AIS是多基因遗传病：家系成员AIS发病年龄在3～20岁，78.91%在10～14岁之间，平均11.8岁，为早发疾病，提示遗传性疾病的可能性大。调查家系总发病率11.74%与参照人群发病率1.04%比较有显著性差异，提示IS有家族聚集性。而且先证者一级亲属发病率>二级亲属发病率>三级亲属发病率，即与先证者的亲缘关系越近，发病率越高，有明显的家族聚集性倾向；虽然具有明显的家族聚集性，但不符合孟德尔遗传法则，结果表明本研究的特发性脊柱侧凸病例不属于单基因遗传病。先证者各级亲属遗传度均大于60%，说明遗传因素在IS发病中起着重要的作用。综合上述结果认为AIS是多基因遗传病。
　　 2.SH3GL1是AIS的候选的致病基因：候选基因SH3GL1，GADD45B，FGF22中的外显子碱基序列对比，分析后发现绝大部分外显子区域均有碱基突变，但大部分碱基突变并未影响氨基酸的翻译。只有在少数AIS患者SH3GL1基因，在第515位的碱基由C突变为T，既CAG突变为TAG，而TAG为终止密码子，在蛋白质翻译过程中终止肽链合成。蛋白翻译时，终止密码子使开放阅读框改变，而出现翻译的肽链缩短，使肽链的一级结构发生改变。基因SH3GL1其余突变位点，及基因GADD45B，FGF22的突变位点，均未影响翻译氨基酸改变。由此可以证明基因SH3GL1可能是AIS疾病候选基因之一。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写一览表

前 言

参考文献

第一部分 青少年特发性脊柱侧凸遗传流行病学调查研究

引言

材料与方法

讨 论

小 结

参考文献

第二部分 染色体19P13.3区域内青少年特发性脊柱侧凸候选易感基因SH3GL1，GADD45B，FGF22外显子序列比对分析研究

引言

资料与方法

试验结果

讨论

小 结

参考文献

全文结论

致谢

文献综述 青少年特发性脊柱侧凸疾病遗传流行病学研究及易感基因研究进展

参考文献

博士在读期间发表文章

英文论著