ROCK1介导的糖皮质激素调节炎症细胞功能的非基因组机制研究

摘要

糖皮质激素(Glucocorticoid GC)主要由肾上腺皮质束状带分泌，是一种具有重要生理及药理作用的甾体类激素，在机体的发育、分化以及代谢、抗炎、抗过敏和免疫调节中起着重要作用。糖皮质激素在不同的细胞类型中均发挥重要作用。
　　 当机体受到多种有害刺激，例如：应激、缺氧、创伤和手术等的时候，糖皮质激素通过下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)的刺激而分泌增多。长期以来，人们普遍认为GC的作用机制为基因组效应，即糖皮质激素在胞膜转运蛋白协助下或者自由通过细胞膜进入胞内，与细胞浆中的受体结合，在分子伴侣蛋白如HSP90的帮助下转移到细胞核内，随后与靶基因启动子附近的特异性的反应元件结合，增强或者抑制靶基因的表达，而发挥其生理学和药理学的作用。但是后来有学者发现GC的作用也可通过另外的一种途径发挥效果，该途径反应时间短，且基因的转录、翻译抑制剂均不能阻止该效果，提示其不经过基因转录和蛋白质的合成过程。人们称为“非基因组效应”或“快速效应”。
　　 现在普遍认为GC的治疗作用是通过4种不同的机制来实现的：1)GC与胞质内GC的受体(cGCR)结合而发生的经典的基因组效应。2)GC与cGCR结合产生的非基因组效应。3)GC与GC的膜受体(mGCR)结合而产生的非基因组效应。4)GC与细胞膜相互作用而产生的非特异性非基因组效应。
　　 在急性炎症反应中，炎性细胞的过度激活是造成机体损伤的关键因素。在急性炎症中，中性粒细胞大量释放内容物、巨噬细胞吞噬功能增强以及炎性细胞粘附力血管内皮细胞能力增强都会对机体造成严重损伤。其中释放内容物和粘附聚集是造成机体损伤的重要因素。而临床上常通过使用大剂量的糖皮质激素来迅速抑制急性炎症的发生发展，但其具体机制并不清楚。
　　 近年来，炎症疾病中的关键调节分子ROCK(Rho-associated coiled-coil proteinkinase)引起人们越来越多的关注。ROCK属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，以两种同源性极高的异构体形式存在(ROKα/ROCK2和ROKβ/ROCK1)。已被证实ROCK1在急性肺损伤、心血管疾病和缺血性脑损害等多种炎症疾病中起重要作用。通过下调ROCK1的表达及活性，或者使用ROCK抑制剂--法舒地尔(Fasudil)可有效减轻上述炎症反应。且有实验证明炎症细胞粘附作用主要受ROCK1水平的调控。
　　 糖皮质激素是否可通过ROCK1而发挥其抗炎效应？如果是的话，哪些是通过基因组效应，还是非基因组效应，尚不明确。
　　 本研究分别以中性粒细胞和U937单核细胞这两种在炎症反应中发挥重要作用的细胞为模型；以佛波酯(phobrolmyristateacetate，PMA)为刺激物；检测糖皮质激素是否通过非基因组效应抑制中性粒细胞和U937单核细胞的功能。并观察ROCK1在其中所起的作用。
　　 主要研究内容及结论：
　　 1.采用Ficoll-泛影钠法分离大鼠中性粒细胞。该梯度离心大鼠外周血的方法可分离出纯度及活力较高的中性粒细胞。
　　 2.10-6M和10-7M的地塞米松可在短时间(5min、15min、30min)内对中性粒细胞在PMA刺激下释放的超氧化物阴离子(Superoxide anion O2-)和髓过氧化物酶(Myeloperoxidase MPO)产生明显的抑制效果。并且该效果并不被糖皮质激素受体拮抗剂-米非司酮(Mifepristone RU-486)和蛋白质合成抑制剂-放线菌酮(CycloheximideCHX)所扭转。结果说明10-6M和10-7M的地塞米松抑制中性粒细胞释放O2-和MPO过程属非基因组效应。
　　 3.ROCK特异性抑制剂--法舒地尔在短时间内对中性粒细胞释放O2-和MPO无显著性抑制作用。提示ROCK并不是该过程的重要调控因子。
　　 4.当给予地塞米松处理后，可在短时间(30min)内有效抑制U937单核细胞对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的粘附作用。该作用并不被米非司酮和放线菌酮所抑制。实验结果说明该作用同样是通过非基因组效应而发挥作用。
　　 5.法舒地尔也可以显著降低U937细胞的粘附，提示ROCK1是单核细胞粘附中的重要影响分子。该抑制效果与地塞米松相似，由此推测地塞米松可通过抑制ROCK1功能而产生抑制U937单核细胞粘附的作用。
　　 6.U937细胞内的ROCK1的活性可被地塞米松和法舒地尔所有效抑制。地塞米松的该作用并不被米非司酮和放线菌酮所抑制，但ROCK1蛋白表达不受影响。该结果说明U937抑制ROCK1功能是通过非基因组效应。
　　 7.地塞米松对U937细胞内RhoA含量和活性并无显著性影响。提示地塞米松并不通过RhoA而影响其下游的ROCK1的功能。
　　 主要结论：
　　 1.较高浓度的地塞米松(10-6M、10-7M)可在短时间内快速抑制受PMA刺激的中性粒细胞释放MPO和O2-。而较低浓度的地塞米松和法舒地尔则无此效应。提示地塞米松的抑制作用通过非基因组途径发挥作用。
　　 2.ROCK1在U937粘附HUVEC过程中发挥了关键作用。地塞米松可通过抑制ROCK1活性不影响其蛋白表达而抑制U937细胞的粘附功能。
　　 3.地塞米松通过非RhoA依赖途径而抑制ROCK1的活性

目录

文摘

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前 言

参考文献

第一部分 糖皮质激素通过非基因组效应抑制中性粒细胞呼吸爆发和脱颗粒与ROCK1的关系

材料与方法

实验结果

讨 论

参考文献

第二部分 ROCK1在糖皮质激素抑制U937单核细胞粘附功能中的作用机制研究

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

全文总结

致谢

文献综述一 糖皮质激素作用机制及其选择性受体激动剂

参考文献

文献综述二 RHO相关的卷曲蛋白激酶在多重细胞行为中的作用

参考文献

攻读硕士期间发表文章