糖皮质激素通过快速非基因组机制抑制中性粒细胞性炎症及提高急性应激耐受力

摘要

糖皮质激素(glucocorticoids，GCs)是由肾上腺皮质分泌的一类甾体分子及其人工合成类似物，它对机体的发育、生长、代谢以及免疫功能等起着重要调节作用，是机体应激反应的枢纽，在应激反应和应激损伤中起关键性作用，也是临床上使用广泛而疗效显著的抗炎、抗过敏和免疫抑制剂。GCs除经典的基因组机制外，还存在着非基因组作用机制。
　　 GCs非基因组机制常见于讨论大剂量冲击疗法的作用机制。在GCs大剂量冲击疗法时，GCs剂量远高于饱和体内所有GCs受体(glucocorticoidsreceptor，GCR)所需要的浓度，对此基因组机制是无法解释的。但是GCs非基因组机制的分子作用靶点仍有待进一步实验研究揭示。糖皮质激素大剂量冲击疗法是急性肺损伤、急性脊髓损伤、COPD、急性活动期类风湿关节炎等众多急重症的特效治疗方法。这些GCs大剂量冲击疗法的适应症中多数病理表现为中性粒细胞(neutrophil，又称多形核白细胞，polymorphonuclearleukocyte，PMN)性炎症损伤，顾名思义，其主要炎症细胞为PMN。PMN是非常关键的固有免疫细胞，从其数量占人外周血白细胞总数的50～70％可见一斑。细菌、病毒、异物等多种刺激均可以活化PMN。活化的PMN是一把双刃剑，它通过吞噬、脱颗粒、呼吸爆发及分泌促炎细胞因子，既参与机体防御功能和免疫反应，同时又可带来组织的继发性损伤，是多种疾病的主要炎症细胞。因而，GCs对PMN作用的研究一直受到广泛的重视。我们课题组前期研究表明大剂量GCs具有快速抑制PMN脱颗粒的效应，而抑制磷酸二酯酶4(Phosphodiesterase4，PDE4)可能是其作用机制之一。本课题研究第一部分在此基础上，以中性粒细胞(neutrophils，PMN)为研究对象，建立了在体和离体炎症模型，以求在整体动物炎症模型证明GCs大剂量冲击疗法中存在非基因组作用；以偶联氨基酸新型GCs进一步验证GCs快速抑制PMN脱颗粒为非基因组效应；并通过研究胞内游离钙离子([Ca2+]i)、胞膜流动性、胞膜脂筏等关键靶点，以其进一步阐明GCs抑制中性粒细胞性炎症的非基因组分子机制。
　　 GCs非基因组机制的临床意义日趋明朗并逐渐被接受，但机体这一与生俱来的重要的调节机制不可能仅为临床用药准备着，必然有其重要的生理调节意义。目前，学术界公认GCs通过基因组机制发挥作用的时间一般至少需要30分钟。故认为在急性应激起始阶段交感-肾上腺髓质轴发挥着重要作用，交感-肾上腺髓质在应激时快速分泌儿茶酚胺，具有兴奋心血管、呼吸系统、升高血糖等防御代偿意义。而许多急性应激反应的初始阶段即有大量糖皮质激素分泌，并有多种生理生化指标产生快速改变。GCs分泌增多是应激反应中最重要的环节。动物实验表明，摘除双侧肾上腺的动物只能在没有应激的状态下生存，轻微的有害刺激即可导致其死亡。但如仅去除肾上腺髓质而保留肾上腺皮质，则动物的生存能力增强。给摘除肾上腺的动物注射GCs，可使动物恢复抗损伤的能力。可见，机体调节应激反应离不开GCs，故我们推测急性应激早期即有GCs非基因组机制参与调节，但是目前还缺乏有力实验依据。因此，在本课题的第一部分，我们以去肾上腺小鼠急性负荷强迫游泳(AcuteWeight-LoadedForcedSwimming，AWLFS)力竭应激模型，观察应激剂量GCs对小鼠游泳力竭时间的快速调节作用，并应用GCs核受体拮抗剂RU486排除经典基因组机制调节作用。在组织器官水平，应用病理切片HE染色和电镜检测了GCs对主要靶器官骨骼肌力竭损伤的快速保护作用。检测血糖、血乳酸、NO、骨骼肌ATP等重要生理和生化指标。在细胞水平，利用小鼠骨骼肌C2C12细胞株分化成肌管细胞，以ACh刺激肌管细胞强直收缩模拟力竭运动，检测GCs对肌管细胞葡萄糖摄取、NO合成释放的影响。探索GCs在调节急性应激反应中的非基因组作用及其初步分子机制。
　　 主要实验结果如下：
　　 一、糖皮质激素通过快速非基因组机制抑制中性粒细胞性炎症：
　　 1.大剂量甲强龙(0.04mg/gbodywti.v.)抑制了甲酰三肽(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine，fMLP)引发的小鼠急性全身性炎症反应血浆MPO、乳铁蛋白等中性粒细胞脱颗粒源性炎性介质释放。
　　 2.偶联氨基酸新型GCs可在其作用10分钟内抑制PMN脱颗粒。
　　 3.大剂量GCs在15分钟内对PMN无细胞毒性作用，反而具有保护作用。
　　 4.GCs加快fMLP激发的PMN[Ca2+]i升高快速恢复正常，并且不能被RU486、CHX阻断。
　　 5.甲强龙(104-4～10-5M)，fMLP自身均具有快速升高PMN胞膜荧光偏振度，降低PMN胞膜流动性的作用。MP与fMLP同时作用下，PMN微黏度较两者中任何一个单独作用都显著降低。
　　 6.甲强龙及偶联BSA的皮质酮预处理可抑制fMLP引发的PMN胞膜脂筏呈多点聚集现象，RU486、CHX均不能阻断这一效应，但是以MβCD破坏胞膜脂筏，对甲强龙抑制PMN脱颗粒效应无影响。
　　 二、糖皮质激素通过快速非基因组机制提高急性负荷强迫游泳力竭应激耐受力：
　　 1.利用去肾上腺小鼠急性负荷游泳力竭应激模型，发现GCs在早期(20分钟内)即可以显著延长小鼠的游泳力竭时间，而GCs受体拮抗剂RU486不能阻断GCs的这一早期效应。
　　 2.在组织器官水平，组织病理观察：HE染色结果显示负荷游泳力竭小鼠骨骼肌部分肌纤维断裂、溶解，GCs能够在作用20分钟内减轻充血和肌纤维的损伤。电镜观察到负荷游泳力竭小鼠腓肠肌肌原纤维部分溶解、肌浆网空泡化，部分M线及Z线模糊消失、线粒体固缩、密度增高，而GCs预处理组损伤不明显。
　　 3.在整体动物水平，GCs快速降低游泳力竭小鼠血浆NO水平，NOS抑制剂L-NAME单独或联用GCs均可延长小鼠力竭时间。GCs可快速抑制ACh引起的肌管细胞NO释放，RU486不能阻断。GCs可快速升高力竭游泳小鼠血糖和骨骼肌组织ATP，并不能被RU486阻断，但在细胞水平抑制骨骼肌细胞葡萄糖摄取。
　　 结论：
　　 以上结果表明：
　　 1.大剂量GCs具有体内外快速抑制PMN脱颗粒的非基因组效应，可能是GCs治疗急性肺损伤、急性脊髓损伤、COPD、RA等许多中性粒细胞性炎症性疾病的重要机制之一；GCs促进fMLP激发的PMN升高快速恢复，可能是GCs快速抑制PMN脱颗粒的非基因组作用靶点之一；GCs对PMN胞膜脂筏、膜流动性的快速作用并非GCs快速抑制PMN脱颗粒的作用靶点。
　　 2.GCs非基因组机制存在于急性应激反应这一生理进程中，应激时GCs大量快速分泌具有其非基因组机制的生理意义；GCs一方面通过快速抑制NO系统过度活化升高骨骼肌组织ATP并解除NO对肌力的直接或间接抑制，另一方面通过抑制骨骼肌等细胞摄取葡萄糖快速升高力竭游泳小鼠血糖途径提高机体对急性力竭应激反应的耐受力。
　　 本研究表明，药理剂量GCs具有非基因组抗炎效应，GCs对[Ca2+]i外流的调节是其可能作用靶点；GCs的生理效应中存在防护应激损伤的非基因组调节机制，NO-NOS系统可能是GCs通过非基因组机制调节急性力竭应激反应，提高急性应激耐受力的关键靶点。本课题研究将为抗应激损伤和抗炎的新型GCs的开发应用提供实验依据。