2型猪链球菌IV型分泌系统virB1-89K基因的生物学功能研究

摘要

2型猪链球菌(Streptococcussuisserotype2,SS2)是一种重要的人畜共患传染病病原体,它不仅可以导致猪感染和急性死亡,还可以通过伤口和呼吸道等途径传染给人,使人致病甚至死亡。以往国内外报道的人感染SS2多为散发病例,且临床表现多以败血症和脑膜炎为主,愈后较好。然而,1998年和2005年在我国江苏和四川两省暴发的两次大规模SS2感染猪和人的公共卫生事件中,病人出现了高比例的链球菌中毒性休克综合征(Streptococcal toxic shock syndrome,STSS),临床表现为高热、休克、多器官衰竭等,病程短且病死率极高(62.7％-81.3%),引起了国内外高度关注。目前,SS2的高致病性及引发STSS的机制尚不清楚。
　　为了对引发两次公共卫生事件SS2流行菌株的高致病性进行研究,本课题组陈晨等人前期通过全基因组测序和比较基因组学分析,发现这两次流行的菌株中含有一个89K毒力岛(PAI89K),且在以往的SS2中并没有发现,而是两次大暴发的SS2菌株所特有的,提示这个毒力岛可能与其引发的高致病性相关。进一步研究发现在89K毒力岛上编码了一个IV型分泌系统(type IV secretion system,T4SS)。T4SS是与细菌接合机制有关的一种分泌系统,在革兰阳性菌、革兰阴性菌、支原体、古细菌等中都有存在。它具有非常广泛的分泌底物,包括单个的蛋白、蛋白-蛋白复合体、蛋白-DNA复合体。它不仅可以通过细菌间的接合作用介导基因水平转移,在细菌间传递抗性基因和毒力基因,还可以将效应蛋白分子注入宿主靶细胞,直接参与细菌致病过程。本课题组在PAI89K上发现的这个T4SS系统,由05SSU0968、05SSU0969、05SSU0971、05SSU0973基因编码产物组成,分别与根癌农杆菌(Agrobacterium tumefacien)T4SS系统中VirB1、VirB4、VirB6和VirD4蛋白有一定相似性,因此我们将PAI89K中T4SS系统各组分命名为VirB1-89K、VirB4-89K、VirB6-89K和VirD4-89K。在根癌农杆菌中,VirB1作为一种胞质蛋白,除了促进T菌毛亚单位形成以外,还具有糖基转移酶的活性,能够裂解N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine,GlcNAc)和N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid,MurNAc)之间的β-1,4糖苷键分解细胞壁肽聚糖,在T4SS系统的装配和致病菌效应分子分泌过程中起到了重要的作用。然而,PAI89K中的VirB1-89K组分与根癌农杆菌中VirB1组分在蛋白质水平上只有10.3%的同源性,尚不足以说明VirB1-89K具有相应的功能,且SS2和根癌农杆菌分属革兰阳性和革兰阴性菌,二者的细胞壁肽聚糖结构有着很大的差异。因此,为了了解PAI89K中VirB1-89K的功能,本研究通过对virB1-89K(05SSU0968)基因进行生物信息学分析,拟运用蛋白纯化技术获得纯化的VirB1-89K蛋白并对其酶学功能进行初步探索,再通过基因敲除技术构建virB1-89K基因缺失株,研究virB1-89K基因与SS2高致病性之间的关系。其实验内容和结果包括以下几个方面:
　　1)IV型分泌系统virB1-89K基因生物信息学分析:利用NCBI(National Centerof Biotechnology Information)数据库上提供的BLAST工具(basic local alignment searchtool)对89K毒力岛上的05SSU0968基因编码产物进行检索分析,发现与根癌农杆菌中的VirB1蛋白相似性不高,于是又运用Pfam软件(http://pfam.sanger.ac.uk/)对05SSU0968基因编码产物进行了功能预测分析,结果显示05SSU0968基因编码产物VirB1-89K含有一个跨膜区和一个CHAP(cysteine,histidine-dependent amidohydrolases/peptidases)功能域。于是又通过BLAST检索获取了SS2VirB1-89K的同源蛋白以及其他细菌中的VirB1蛋白,进行了分子系统发生树分析,结果提示VirB1-89K蛋白与停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)和粪肠球菌(Enterococcus faecium)中的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶的进化距离最近,而与其他已确定的VirB1蛋白进化距离较远。蛋白质结构预测结果显示VirB1-89K蛋白与腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)中含有CHAP功能域的酰胺酶二级和三级结构相似,并都含由组氨酸和半胱氨酸组成的活性中心。所有结果均提示SS2VirB1-89K蛋白可能为一种具有N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶活性的水解酶,但尚需要实验进一步证实。
　　2)virB1-89K基因CHAP功能域的克隆、表达与纯化:通过PCR反应扩增到virB1-89K基因的CHAP功能域DNA片段,并将其插入原核表达载体pET-21a中,成功构建了重组质粒pET21a-CHAP。该重组质粒经NdeI和XhoI双酶切鉴定正确后,送华大基因测序显示重组质粒构建成功。将重组质粒化转到大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中,获得能够稳定表达的基因工程菌。通过优化条件使目的蛋白在上清中表达,故对融合蛋白上清行非变性Ni-NTA柱亲和层析,最后获得单一条带的目的蛋白。
　　3)VirB1-89K蛋白CHAP功能域酶活性的测定:提取并纯化SS2细胞壁肽聚糖,采用酶谱电泳法、抑菌实验检测VirB1-89K蛋白CHAP功能域对细胞壁肽聚糖的降解活性,结果表明VirB1-89K蛋白CHAP功能域对SS2肽聚糖具有显著降解作用。进一步通过浊度实验确定VirB1-89K蛋白CHAP功能域酶活性的最适合pH值为8,最适温度为40℃以及酶的热稳定性。
　　4)virB1-89K基因敲除株和互补株的构建:以05ZYH33基因组为模板,分别扩增virB1-89K基因的上下游片段和pSET2上的Spcr(spectinomycin resistance cassette)基因,然后依次克隆于pUC18质粒中,构成敲除质粒。再将其电转化到05ZYH33感受态细胞中,筛选含spc抗性的菌株,并通过多重PCR和测序确定敲除株构建成功。再以05ZYH33基因组为模板,分别扩增SS2的sly基因启动子(Psly)和virB1-89K基因,克隆到pSET1穿梭质粒中,构成互补质粒,然后电转入virB1-89K敲除株感受态细胞中,用Cm和Spc双重抗性平板初筛互补株后,最后用PCR验证互补株构建成功。
　　5)?virB1-89K菌株基本生物学特性和毒力变化分析:在相同培养条件下观察野生株05ZYH33、敲除株?virB1-89K、互补株CvirB1-89K基本生物学性状有无差异,结果发现,三者生长曲线、溶血活性、荚膜形态均没有明显差异。当用相同致死剂量的三株细菌分别攻击BALA/c小鼠时,发现野生株和互补株都出现了典型的SS2感染症状,12h小鼠死亡率为100%,而突变株组的小鼠攻击12h后全部存活,截止观察时间7天结束,小鼠仍有70%的存活率,且均未发现有任何发病症状。互补株与野生株的情况基本吻合,24h内小鼠全部死亡。结果表明:virB1-89K基因的缺失导致细菌致病性大大降低。
　　综上所述,本研究通过生物信息学预测VirB1-89K可能是一个N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶,并通过实验证明其确实具有裂解肽聚糖的活性。再通过构建virB1-89K基因敲除株和互补株,发现virB1-89K基因缺失后细菌基本生物学性状并没有明显改变,动物实验结果显示:virB1-89K基因的缺失导致细菌毒力明显下降。

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缩略语表

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第一章 前 言

第二章 T4SS系统virB1-89K基因生物信息学分析

2.1 前言

2.2分析方法

2.3 结果

2.4 讨论

第三章 T4SS系统virB1-89K基因生物学活性的初步研究

3.1 T4SS系统virB1-89K基因的克隆、表达及纯化

3.2 重组蛋白的生物学活性鉴定

第四章 2型猪链球菌基本生物学性状和毒力分析

4.1 T4SS系统virB1-89K基因敲除株的构建

4.2 T4SS系统virB1-89K基因互补株的构建

4.3?virB1-89K菌株基本生物学性状的分析

4.4 ?virB1-89K菌株毒力变化分析

全文总结

参考文献

文献综述糖基转移酶在细菌大分子转运中的作用

参考文献

攻读硕士学位期间发表的文章

致谢