多巴胺D3受体对醛固酮介导的促血管平滑肌细胞增殖和迁移作用的影响及机制

摘要

一、研究背景：
　　高血压(Essential Hypertension,EH)及其并发症已成为影响人们健康的主要原因,高血压同时是冠心病、肾衰竭、中风等多种疾病的主要危险因素,因此明确EH的发生、进展机理对寻找有效的防治措施显得尤其重要[1]。血压长期升高引起全身小动脉血管重塑(vascular remodeling),表现为小动脉管壁增厚、管腔狭窄,是高血压导致心、脑、肾等靶器官损害的病理基础[2]。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(Renin-AngiotensinⅡ-Aldosterone system,RAAS)异常激活在EH发生发展及血管重构中的作用已得到人们公认[3]。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的异常增殖、迁移在血管重塑中扮演中心角色[4]。VSMCs的增殖、迁移受到了众多神经体液因子的调节,其中RAAS的主要因子血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)的作用尤为重要,而RAAS的另一重要成员醛固酮在心血管重塑中的作用亦逐渐受到重视[5,6]。研究发现,醛固酮对血管壁有直接作用,作用于VSMCs,可以促进其增殖、肥大、炎症及衰老化改变[7]。醛固酮不仅对VSMCs有直接的促增殖作用[8],还能增强经典的促增殖因子AngⅡ对VSMCs的促增殖作用[9]。醛固酮还可通过激活c-Src激酶途径,增强AngⅡ介导的促VSMCs迁移效应[10]。AngⅡ可刺激醛固酮的分泌,醛固酮反过来又可上调VSMCs上AngⅡ1型受体(AT1R)的表达[11],醛固酮与AngⅡ之间的这种相互协同作用可能在血管重构中发挥重要作用[12]。
　　在过去20~30年,多巴胺及其受体在高血压发生中的作用逐渐受到重视。多巴胺受体可分为D1类受体(包括D1和D5)和D2类受体(包括D2、D3、D4)两大类共5种亚型,5种亚型受体中任何一种受体基因敲除的小鼠均发生高血压[13]。多巴胺受体的5种亚型均直接或间接通过与其他血压调节系统(如交感神经系统、RAAS等)的交互作用,参与对肾脏尿钠排泄及血压的调节[14]。作为D2类多巴胺受体的主要亚型,D3受体在肾脏以及动脉血管壁各层均有表达,在血压调节中发挥重要作用[13]。D3受体基因敲除(D3-/-)小鼠发生肾素依赖性高血压,肾脏肾素活性、AT1R蛋白表达均明显升高[14]。而刺激D3受体可促进尿钠排泄,并减少肾脏组织肾素的生成、降低AT1R蛋白的表达[15],提示多巴胺D3受体与RAAS的相互作用可能在肾脏功能以及血压调节中发挥重要作用。
　　刺激D3受体在肾脏可产生利钠排尿的作用,在血管刺激D3受体则可使苯肾上腺素或AngⅡ预先收缩的动脉血管舒张[13]。我们既往的研究发现,激动多巴胺D3受体能够抑制去甲肾上腺素[16]、胰岛素[17]介导的促VSMCs增殖效应,激动多巴胺D3受体还能够抑制神经肽-Y介导的促VSMCs迁移效应。RAAS在高血压血管重构中的作用已得到公认,AngⅡ介导促VSMCs增殖、迁移效应,而醛固酮除自身有直接的促VSMCs增殖作用外,还能增强AngⅡ对VSMCs的促增殖、迁移作用,其与AngⅡ之间的这种协同作用在血管重构中的作用是近年来研究热点[12]。在肾脏,多巴胺D3受体与RAAS间通过一种负性相互作用在调节水钠排泄中发挥相反的作用[15],那么它们在血管壁是否存在类似的相互作用呢?多巴胺D3受体对醛固酮以及AngⅡ在VSMCs上的促增殖、迁移效应是否存在影响?结合我们既往的研究,我们推测:多巴胺D3受体对醛固酮以及AngⅡ介导的促VSMCs增殖、迁移作用具有调节作用,这种调节作用可能参与了高血压血管重构的发生发展。
　　二、研究目的：
　　本实验通过观察A10细胞(大鼠胸主动脉平滑肌细胞株)在醛固酮、AngⅡ、多巴胺D3受体激动剂共同刺激的情况下,A10细胞增殖、迁移的变化情况,了解D3受体是否通过对醛固酮以及AngⅡ介导的促VSMCs增殖、迁移作用发挥影响,了解D3受体与RAAS在高血压血管重塑过程中的相互作用。
　　研究内容:
　　1.A10细胞的培养,采用不同浓度的醛固酮作用于A10细胞,观察醛固酮对A10细胞增殖的影响。
　　2.用不同浓度的多巴胺D3受体激动剂PD128907作用于A10细胞,观察单纯激动多巴胺D3受体对A10细胞增殖的影响。进一步观察PD128907预先刺激的情况下,醛固酮对A10细胞增殖的作用的变化。
　　3.观察醛固酮刺激对A10细胞的磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)表达的影响,以及在PD128907预先激动多巴胺D3受体的情况下,该作用的变化。探讨激动多巴胺D3受体对醛固酮促A10细胞增殖效应发生影响的具体机制。
　　4.观察AngⅡ对A10细胞迁移的影响,以及在不同浓度醛固酮及AngⅡ(醛固酮/AngⅡ)共同刺激情况下,A10细胞迁移作用的变化。用不同浓度的PD128907作用于A10细胞,观察单纯激动多巴胺D3受体对VSMCs迁移的影响。
　　5.观察PD128907预先刺激的情况下,醛固酮/AngⅡ对VSMCs迁移效应的变化。如果激动多巴胺D3受体能影响醛固酮/AngⅡ促VSMCs迁移效应,进一步研究其具体机制。
　　三、研究方法：
　　1.A10细胞(胚胎大鼠胸主动脉平滑肌细胞株)的传代培养。
　　2.细胞增殖检测的方法采用[3H]-TdR掺入法、CCK-8、细胞计数方法。
　　3.细胞迁移检测的方法采用细胞迁移Transwell实验、细胞划痕愈合实验。
　　4.细胞蛋白表达检测采用Western blot方法。
　　四、研究结果：
　　1.醛固酮刺激浓度依赖性地促进A10细胞增殖。单纯激动多巴胺D3受体对A10细胞增殖无明显影响,但激动多巴胺D3受体可显著降低醛固酮促A10细胞增殖的作用,且该作用呈浓度依赖性。
　　2.醛固酮刺激A10细胞p-ERK1/2表达上升,而激动多巴胺D3受体抑制了醛固酮的这种作用。
　　3.AngⅡ浓度依赖性地促进A10细胞迁移。低浓度醛固酮刺激本身对细胞迁移没有影响,但是可以显著增强低浓度AngⅡ的促A10细胞迁移作用。氯沙坦及螺内酯均可阻断这种协同促迁移作用。
　　4.刺激多巴胺D3受体本身对A10细胞迁移没有影响,但可浓度依赖性地抑制低浓度醛固酮/AngⅡ协同促A10细胞迁移作用。PKA抑制剂阻断了刺激多巴胺D3受体对醛固酮/AngⅡ协同促迁移效应的抑制作用。
　　五、结论：
　　激动多巴胺D3受体下调p-ERK1/2的表达,抑制了醛固酮促进A10细胞增殖的作用。激动多巴胺D3受体通过激活PKA抑制了醛固酮/AngⅡ促A10细胞迁移的作用。多巴胺D3受体与RAAS之间的相互作用可能在高血压血管重塑的发生发展中起重要作用。

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第一章 前言

第二章 多巴胺D3受体对醛固酮介导的促血管平滑肌细胞增殖作用的影响

2.1 材料和方法

2.1.1 材料

2.1.2 方法

2.1.3 统计学处理

2.2 结果

2.2.1 醛固酮对A10细胞增殖的影响

2.2.2 D3受体对A10细胞增殖的影响

2.2.3 D3受体对醛固酮促A10细胞增殖作用的影响

2.2.4 CCK-8法验证D3受体对醛固酮促A10细胞增殖作用的影响

2.2.5 D3受体对醛固酮促A10细胞增殖作用影响的机制

2.3 讨论

2.4 结论

第三章 多巴胺D3受体对醛固酮/AngⅡ介导的促血管平滑肌细胞迁移作用的影响

3.1 材料和方法

3.1.1 材料

3.1.2 方法

3.1.3 统计学方法

3.2 结果

3.2.1 AngⅡ对A10细胞的促迁移作用

3.2.2 醛固酮对AngⅡ促A10细胞迁移作用的增强作用

3.2.3 PD128907对醛固酮/AngⅡ促A10细胞迁移作用的影响

3.2.4 PD128907对醛固酮/AngⅡ促A10细胞迁移作用影响的机制

3.3 讨论

3.4 结论

全文结论

参考文献

参考文献

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