多巴胺受体对神经肽Y受体介导的促血管平滑肌细胞的增殖和迁移的影响及机制

摘要

一、研究背景
　　动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是严重危害人类健康的常见病和多发病，随着对AS研究的深入，人们对AS的认识有了巨大的进步，但AS病因仍不明了，因此明确AS的发生机理对于AS的防治具有重要的意义。目前，AS的发病机制存在多种学说，如脂质浸润学说、脂蛋白氧化应激修饰损伤学说、炎症学说、致突变学说、血栓形成学说、内皮细胞损伤学说、平滑肌细胞克隆学说等，但AS的具体机制尚未完全阐明。平滑肌细胞克隆学说与AS的关系已被证实，血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells， VSMCs）异常增殖、VSMCs迁移至内膜，形成AS斑块，导致血管壁增厚、管腔狭窄、血管顺应性降低，VSMCs生物学功能的改变在原发性高血压（Essential Hypertension，EH）、AS和血管成形术后管腔再狭窄等血管平滑肌增殖性疾病的发生与发展中发挥重要的作用。
　　交感神经系统在心血管系统中的调节作用已经得到公认,神经肽 Y(Neuropeptide Y,NPY)做为交感神经分泌的主要神经递质之一,是1982年从猪脑组织中发现并分离提纯出来，由36个氨基酸组成的多肽，属于胰多肽家族。NPY广泛分布于哺乳动物的中枢及外周交感神经系统，在血压调节、血管的狭窄及AS的发生、发展过程中发挥重要作用。NPY不仅对血管产生直接的缩血管作用，还能加强肾上腺素、去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)和内皮素等缩血管物质对血管的收缩作用，使血压进一步升高。在高血压状态下，无论是高血压病人还是自发性高血压大鼠（Spontaneously hypertensive rat， SHR）模型，血浆中的NPY浓度明显升高。而且在高血压状态下，NPY受体的亲和力增加。已有研究发现，NPY对内皮细胞、VSMCs有强烈的促增殖、促迁移作用，加剧AS病变发展过程。交感神经系统中还存在另一重要的神经递质—多巴胺。多巴胺受体属于视紫红质类家族。多巴胺系统在心血管系统中的调节作用已得到越来越多学者的关注。小剂量的多巴胺可以通过作用多巴胺D1受体发挥舒血管作用。在肾脏及动脉系统均有表达，起着舒张血管、利钠排尿的作用。在我们以前的实验中，证实了在高血压状态下，多巴胺受体的功能受损，多巴胺受体介导肾脏排钠利尿作用降低，血容量增多，血压升高。敲除多巴胺受体，引起基因敲除小鼠血压的明显升高。多巴胺受体本身对VSMCs的增殖并无影响，但多巴胺D1类、D3受体的激活对NE、胰岛素介导的促VSMCs增殖作用具有明显的抑制作用。近年的诸多学者研究发现，激活多巴胺D1类，能抑制血小板源性生长因子（Platelet-Derived Growth Factor,PDGF)-BB介导的促VSMCs迁移、增殖作用。因此，多巴胺及其受体有可能通过拮抗?-肾上腺素能神经系统及交感神经系统发挥直接、间接抗AS病变形成的作用。
　　NPY与NE同属交感神经递质，在某些疾病或应激状态下，二者与多巴胺的神经递质囊泡在外周神经系统同时释放，所以，我们推测NPY与多巴胺之间的相互作用有可能参与了AS的发生、发展。
　　二、研究目的
　　本实验通过观察SD（Sprague-Dawley Rats）大鼠原代VSMCs在多巴胺D1类受体或多巴胺D3类受体与NPY受体共同激活共同的情况下，观察VSMCs增殖、迁移作用的变化，了解多巴胺与NPY在AS发生发展过程中的相互作用。
　　三、研究内容
　　1．SD大鼠原代VSMCs培养的分离、培养。证实NPY对SD大鼠原代VSMCs的促增殖作用，以及NPY对SD大鼠原代VSMCs的促增殖作用是通过NPY哪个亚型受体发挥作用。
　　2．用不同浓度的多巴胺D-1类受体激动剂fenoldopam作用于VSMCs，观察fenoldopam对VSMCs本身有无增殖作用。
　　3．观察NPY与fenoldopam同时存在的情况下，VSMCs的增殖作用有无发生改变，如果VSMCs的增殖作用发生改变，那么多巴胺D-1类受体的激活通过何种机制对NPY促VSMCs细胞的增殖发生影响。
　　4．观察NPY对SD大鼠原代VSMCs是否有促迁移作用，以及NPY对SD大鼠原代VSMCs的促迁移作用是通过NPY哪个亚型受体发挥作用。
　　5．用不同浓度的多巴胺D-3类受体激动剂PD128907作用于VSMCs，观察PD128907对VSMCs本身有无迁移作用。如果VSMCs的迁移作用发生改变，那么多巴胺D-3类受体的激活通过何种机制对NPY促VSMCs细胞的迁移发生影响？
　　四、研究方法
　　1．SD大鼠原代VSMCs培养的培养采用血管组织法培养。SD大鼠原代VSMCs的鉴定采用细胞形态学方法及细胞免疫组织化学方法。
　　2．细胞增殖检测的方法采用[H3]-TdR、MTT、细胞计数方法。
　　3．细胞迁移检测的方法采用细胞迁移Transwell实验、细胞划痕愈合实验方法。?
　　五、研究结果
　　1．经培养出来的原代VSMCs,在倒置显微镜下观察：细胞彼此融合,细胞密集呈束状放射状排列,形成典型的―峰-谷‖样生长特征。经纯化后，第4代VSMCs用抗SM- actin抗体，经细胞免疫组织化学方法检测鉴定为VSMCs。
　　2．NPY呈浓度依赖性对 SD大鼠原代 VSMCs有明显的促增殖作用，此增殖作用被NPY Y1亚型受体抑制剂BIBP3226所阻断。
　　3．多巴胺 D-1类受体激动剂 fenoldopam本身对 VSMCs增殖作用并无影响。但在fenoldopam与NPY同时存在的情况下，NPY对VSMCs的增殖作用则被抑制。蛋白激酶A（Protein kinase A，PKA）抑制剂阻断了fenoldopam对NPY促VSMCs的增殖作用。
　　4．NPY呈浓度依赖性对 SD大鼠原代 VSMCs有明显的促迁移作用，此迁移作用被NPY Y1亚型受体抑制剂BIBP3226所阻断。
　　5．多巴胺 D-3类受体激动剂 PD128907本身对 VSMCs的迁移作用并无影响，但在PD128907与NPY同时存在的情况下，NPY对VSMCs的迁移作用则被抑制。PKA抑制剂阻断了PD128907对NPY促VSMCs的迁移作用。
　　六、结论
　　NPY通过NPY Y1亚型受体促SD大鼠原代VSMCs增殖和迁移。多巴胺D-1类受体通过PKA抑制VSMC增殖、D3受体通过PKA抑制VSMC迁移；多巴胺受体与NPY受体之间的相互作用有可能参与AS的发生、发展过程。

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前言

参考文献

材料和方法

第一部分 多巴胺D1类受体对神经肽Y受体介导的促血管平滑肌细胞增殖作用的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

第二部分 多巴胺D3受体对神经肽Y受体介导的促血管平滑肌细胞迁移的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

全文结论

致 谢

神经肽Y及其亚型受体在动脉粥样硬化中的作用

1 NPY 的生物学结构

2 NPY在动脉粥样硬化发生发展中的作用

3 NPY基因多态性在动脉粥样硬化中的作用

4 结语

参考文献

研究生期间发表文章