NT-3修饰脱细胞脊髓支架的制备及治疗脊髓损伤的实验研究

摘要

背景:
　　随着交通事故、外伤以及运动性损伤的不断增加,脊髓损伤呈逐渐上升的趋势。脊髓损伤是由于多种原因造成的脊柱脱位或骨折等导致的脊髓受压、水肿、出血、挫伤或断裂,是中枢神经系统的一种严重创伤。脊髓损伤所致截瘫,具有很高的致残率,对社会对家庭的影响很大。目前,对全世界的科研工作者而言,治疗脊髓损伤的方法仍在不断探索之中。
　　目前脊髓损伤实验性治疗主要包括局部或整体的药物治疗,细胞移植的治疗,基因工程技术,理化治疗以及新兴的组织工程治疗。随着组织工程技术在1987年在华盛顿的生物医学小组会上提出至今,人们开始意识到组织工程技术是最有可能达到治疗脊髓损伤目的的技术之一。近年来有文献报道[1-2],支架材料、种子细胞以及促生长因子是组织工程的三要素,其中支架材料的构建是关键。
　　所谓脊髓组织工程是指通过体外分离、培养相应种子细胞,然后将一定数量的种子细胞种植到类似人体脊髓三维支架的生物材料上,继续体外扩增、培养,形成细胞-生物材料复合物,再种植到相应脊髓节段上,最终形成具有一定结构和功能的脊髓节段,从而达到治疗脊髓损伤的作用。现有的组织工程支架[3]包括以壳聚糖为代表的天然可降解支架,以聚乳酸聚羟基乙酸共聚体为代表的人工合成高分子材料支架,以及复合材料支架,他们或存在三维仿生结构不足,或生物相容性欠佳等不足,限制了其在SCI再生修复中的应用。近年来一种新的趋势是采用天然脱细胞组织材料来构建新型组织工程支架,并在构建组织工程化心瓣膜[4]、角膜[5]、骨[6]、软骨[7]、血管[8]、皮肤[9]、膀胱[10]、肌肉[11]、周围神经[12]等方面已有广泛应用。
　　目的:
　　本课题组前期已初步制备出同种异体脱细胞脊髓支架[13],该支架具有如下优势:①保留了Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等脊髓组织细胞外基质成分,有利于细胞的粘附生长[14];②具有最接近脊髓组织的三维结构,能为轴突再生提供伤前相似的通道从而引导轴突正确生长[15];③具有良好的生物相容性,免疫原性微弱,可承载神经干细胞生长、增殖[16];④具有与正常脊髓相似的生物力学性能,适宜于体内移植研究[13]。但该方案所制备脱细胞脊髓支架共需31小时,耗时较长,有学者表明[17],脱细胞组织即使在PBS中也会保持一个恒定的降解率,故前期方案仍有需改进、优化的地方。因此我们希望引入一种外界因素来优化前期方案,使得优化后的方案既能明显缩短脱细胞时间,又能很好的达到脱细胞效果。
　　生物超声处理技术,即利用一定剂量的超声能量及由之引发的声空化效应来影响物质的结构、状态及特性,或者强化某些物理、化学、生物过程,提高过程的质量或效率。超声波主要是通过其机械作用、热效应和空化效应等对生物组织的细胞产生破坏作用,从而达到脱细胞的目的。有学者[18]通过反复冻融配合超声振荡洗涤成功制备出了猪脱细胞真皮基质。将超声脱细胞技术引入脱细胞脊髓制备方法中尚未见文献报道。
　　基于这一理念,本研究拟在反复冻融、化学萃取、机械振荡方法的基础上引入超声振荡因素来构建同种异体脱细胞脊髓支架并优化脱细胞方案,既缩短脱细胞处理时间又彻底去除细胞成分,进一步完善支架的三维网状结构。但是单纯支架植入并不能改变移植区神经营养因子匮乏的现状,我们希望引入一种特定的神经营养因子并将其整合到脱细胞脊髓支架当中。大量文献已经表明NT-3对脊髓损伤修复的促进作用,因此通过补充NT-3来治疗脊髓损伤成为一种行之有效的方法[19-20]。故本研究拟通过一些列方法将NT-3整合到脱细胞脊髓支架当中,并应用复合NT-3的脱细胞脊髓支架等位移植修复大鼠脊髓全横断损伤,进一步研究移植对损伤区瘢痕形成的影响,损伤区神经电生理传导的影响以及与实验大鼠后肢运动功能恢复之间的相互关系。为后续开展脊髓损伤的基础与临床研究提供新思路、新方法和理论依据,具有重要的科学意义和社会价值。
　　方法:
　　1、大鼠脱细胞脊髓支架制备方法改良的实验研究
　　1.1、脱细胞优化方案的确定:采用超声振荡、反复冻融、化学萃取以及机械振荡综合作用的方法制备脱细胞脊髓支架,并应用大体形态学观察、HE染色、及扫描电镜观察等方法检测脱细胞效果以确定最佳脱细胞方案。
　　1.2、脱细胞脊髓支架理化特性研究:通过扫描电子显微镜自带软件对经优化处理的脱细胞脊髓支架行孔径大小检测,采用液体置换法对脱细胞脊髓支架行孔隙率测定,并将干燥处理的正常脊髓组织与优化方案处理后的支架对比测定该支架的含水率。
　　1.3、脱细胞脊髓支架降解特性研究:通过对优化处理后的脱细胞脊髓支架行酶解率以及失重率测定,从而评价支架在体外模拟降解环境中的降解特性。
　　2、NT-3修饰脱细胞脊髓支架的实验研究:
　　将NT-3通过直接吸附法整合到脱细胞脊髓支架中,并通过药物溶出仪处理,计算出该支架的载药量及载药率,为移植支架提供量化标准。
　　3、复合NT-3的脱细胞脊髓支架移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究:
　　将144只成年SD大鼠随机分成4组,每组36只,雌雄不拘。其中A组为单纯椎板切除组(阳性对照组),B组为脊髓全横断组(阴性对照组),C组为单纯支架移植组,D组为复合NT-3支架移植组。在2周、1月、2月、3月及6月分别对各组大鼠行BBB运动评分、神经电生理检查、移植区脊髓大体形态学观察、组织学观察等。通过这一系综合评定方法来评价复合NT-3的脱细胞脊髓支架对大鼠脊髓损伤的治疗作用。
　　结果及结论:
　　1、大鼠脱细胞脊髓支架制备方法改良的实验研究
　　1.1、用超声振荡、反复冻融、化学萃取以及机械振荡的综合方案能达到较好的脱细胞效果,且用时较前期方案少,该支架同样具有良好的三维网状结构,细胞脱除彻底,细胞外基质保持较为完整。
　　1.2、通过优化处理的脱细胞脊髓支架原有细胞成分被有效去除,具有94.57±3.45％的孔隙率和88.62±1.0%的含水率以及良好的三维空间结构(平均孔径为46μm),显示出支架材料具有良好的结构特性;
　　1.3、构建的脱细胞脊髓支架在胰酶溶液中逐步降解,在第20h达到69.03±2.19%,在双蒸水中逐步崩解,在第8天可达62.55±1.70%;
　　2、NT-3修饰脱细胞脊髓支架的实验研究:
　　NT-3能够较为稳定的复合到脱细胞脊髓支架中,并能使每克支架的NT-3载药量达0.53±0.07μg,即支架的载药率为0.53±0.07μg/g;
　　3、复合NT-3的脱细胞脊髓支架移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究:
　　BBB运动评分中,在脊髓移植后2月、3月、6月时,D组略高于C组,但均高于B组并明显低于A组(P<0.01)。C组、D组大鼠MEPN1波的潜伏期在2周、1月、两月明显短于B组而长于A组(P<0.01),且C组、D组大鼠MEPN1波得波幅在损伤后3月、6月明显高于B组而低于A组(P<0.01)。且在几个时像点中D组大鼠MEPN1波得潜伏期均略短于C组,波幅均略高于C组。移植区大体形态学结果显示,1月、2月、3月、6月,C组、D组脊髓横断区连续性已恢复。HE染色结果也显示C组、D组脊髓横断区已有新生组织长入,有一定的连续性。

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第一章 前言

第二章 大鼠脱细胞脊髓支架制备方法改良的实验研究

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

第三章 NT-3修饰脱细胞脊髓支架的实验研究

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

第四章 复合NT-3的脱细胞脊髓支架移植治疗大鼠脊髓损伤

4.1 材料与方法

4.2 结果

4.3 讨论

全文结论

参考文献

文献综述一嗅鞘细胞治疗脊髓损伤的研究进展

参考文献

文献综述二脱细胞技术在同种异体组织工程支架中的研究进展

参考文献

文献综述三组织工程脊髓支架在治疗脊髓损伤中的研究进展

参考文献

研究生期间撰写和发表的文章

致谢