丙烯酰胺诱导HT22小鼠海马神经元损伤作用的研究

摘要

丙烯酰胺（Acrylamide，ACR）是一种高水溶性的α,β-不饱和羰基化合物，主要用来合成聚丙烯酰胺，聚丙烯酰胺在采矿业、污水净化、造纸业等领域应用广泛。聚丙烯酰胺无毒，但丙烯酰胺单体是有毒的。自2002年科学家们发现富含淀粉的食物在经受高温油炸或烘烤时能生成丙烯酰胺后，其危害日益引起人们的重视。动物实验证实，丙烯酰胺具有神经毒性、致癌性、遗传毒性、生殖毒性，但在人群中却只发现了它的神经毒性。丙烯酰胺神经毒性的临床表现为共济失调、骨骼肌无力，体重减轻；病理表现为中枢和周围神经轴突的远端肿胀和终末变性，并逐渐向近端扩展。
　　丙烯酰胺引起神经毒性的可能机制主要有抑制快速轴突运输、改变神经递质水平和功能、抑制神经递质的释放、影响细胞骨架系统、抑制中枢神经系统的能量代谢等。此外，氧化应激和促进细胞凋亡也可能是丙烯酰胺潜在的神经毒性机制。我们实验室前期工作已证实：丙烯酰胺亚急性染毒能够引起幼年大鼠神经系统功能损伤，大脑皮质内神经元和小脑皮质内浦肯野细胞发生变性损伤；胚胎期和哺乳期暴露于丙烯酰胺能导致幼鼠出生时体重降低，哺乳期间体重增长缓慢，并影响到海马神经元的发育。海马主要参与学习、记忆、情绪反应等多种功能活动，其损伤能对学习记忆产生影响，有研究证实丙烯酰胺能够损伤海马，但损伤的具体机制目前尚不明确。
　　为此，我们开展了丙烯酰胺的体外毒性研究。HT22细胞是一种永生化的小鼠海马神经元细胞，具有典型的神经元形态及特征，其表型与神经元前体细胞最为相似，被广泛应用于研究药物的神经毒性、神经元的损伤和保护之中。但用HT22细胞来建立丙烯酰胺体外损伤模型的相关研究少见报道，故本研究以HT22细胞为细胞模型，研究丙烯酰胺对海马神经元的损伤作用，并对其损伤的可能机制进行探讨。
　　方法：
　　1.丙烯酰胺对HT22细胞存活率的影响及模型浓度的筛选：当HT22细胞生长至对数期时，加入不同浓度的丙烯酰胺，处理24h、36h和48h，MTT法检测细胞的增殖状态，并选择合适的浓度进行后续的实验。
　　2.丙烯酰胺对HT22细胞损伤的影响研究：当HT22细胞生长至对数期时，加入不同浓度的丙烯酰胺处理24h后，倒置显微镜下观察各组细胞的形态变化；Hoechst33258染色来观察各组细胞核的变化；应用试剂盒检测乳酸脱氢酶（LDH）的漏出量。
　　3.丙烯酰胺对HT22细胞氧化应激的影响研究：用DCFH-DA荧光探针来检测活性氧ROS的含量；黄嘌呤氧化法检测超氧化物歧化酶（SOD）的活力；硫代巴比妥酸（TBA）法检测丙二醛（MDA）的含量；二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）法检测还原型谷胱甘肽（GSH）的含量。
　　4.丙烯酰胺对HT22细胞凋亡的影响研究：罗丹明123（Rh123）染色检测线粒体膜电位（MMP）的变化；Western blot法检测Bax、Bcl-2、Cleaved caspase3蛋白的表达。
　　结果：
　　1.不同浓度的丙烯酰胺（0、1、2、3、4、8、16mmol/ L）处理HT22细胞24h、36h和48h后，细胞存活率随着浓度的增加和时间的延长而降低，说明丙烯酰胺对HT22细胞存活率的影响呈时间和剂量依赖性。
　　2.我们选用0、1、2、3mmol/ L的丙烯酰胺浓度处理HT22细胞24h来作为后续实验的损伤浓度。倒置显微镜下观察到随着浓度的升高，细胞胞体逐渐变圆，突起变短，折光率下降；用Hoechst33258染料染色，对照组细胞核均匀淡染，边缘清晰；而染毒组的细胞核有深染固缩、形状不规则、裂解的核出现，与对照组相比异常核的数量也有增加；且随着ACR浓度的增加，培养上清中LDH的含量也显著增加（P<0.05 vs对照组）。
　　3.丙烯酰胺处理HT22细胞24h后，细胞内ROS的积聚增加，MDA的含量升高，SOD的活性下降，GSH的含量下降。
　　4.丙烯酰胺处理HT22细胞24h后，细胞线粒体膜电位下降；Bax和Cleaved caspase3蛋白的表达水平上调，Bcl-2蛋白的表达水平下调。
　　结论：
　　1.丙烯酰胺可以抑制HT22细胞的增殖，且对其影响呈时间和剂量依赖性。
　　2.丙烯酰胺染毒能导致HT22细胞形态改变、细胞核凋亡、细胞膜损伤。
　　3.丙烯酰胺的神经毒性机制，可能是通过增加细胞内ROS的积聚和MDA的含量，降低SOD的活性和GSH的含量，产生氧化应激损伤来实现的。
　　4.丙烯酰胺的神经毒性机制，还可能与降低线粒体膜电位，上调Bax和Cleaved caspase3蛋白的表达，下调Bcl-2蛋白的表达，进而诱发HT22细胞的凋亡有关。

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中文摘要

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序言

材料与方法

1. 实验材料

2. 实验方法

结果

1 不同浓度ACR对HT22细胞存活率的影响

2 不同浓度ACR对HT22细胞形态的影响

3不同浓度 ACR对HT22细胞核形态的影响

4 不同浓度ACR对HT22细胞乳酸脱氢酶（LDH）漏出量的影响

5不同浓度ACR对HT22细胞内活性氧（ROS）的影响

6 不同浓度 ACR 对 HT22 细胞中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、还原型谷胱甘肽（GSH）的影响

7.不同浓度ACR对HT22细胞内线粒体膜电位（MMP）的影响

8.Western blot法检测HT22细胞中凋亡相关蛋白

讨论

1. ACR对HT22细胞具有毒性损伤作用

2. ACR对HT22细胞的损伤可能与氧化应激有关

3.ACR对HT22细胞的损伤可能与促进细胞凋亡有关

结论

参考文献

中英文缩略词表

攻读学位期间发表的论文

致谢