母血浆中胎儿游离DNA无创产前诊断β-地中海贫血方法的研究

摘要

背景和目的:
　　常用遗传性疾病产前诊断技术手段多为有创性操作,对孕妇及胎儿均有一定伤害,以致在临床推广及应用中受到限制。而非侵入性的产前检查方法如中孕期母血清HCG、AFP定量及超声检查的检测范围各有侧重,仅能作为遗传性疾病筛查的一种手段,不能作为诊断依据。近年来,随着胎儿游离 DNA的研究不断深入使无创产前诊断方法取得巨大进展,利用孕妇血浆检测胎儿性别、RhD基因已经在国外的一些产前诊断中心开展;利用全基因组高通量测序及数字 PCR等方法检测单基因疾病已有报道,目前仍处于研究阶段,成本昂贵,而且操作十分复杂。
　　β-地中海贫血(简称β-地贫)是一种由β-珠蛋白基因突变导致β-珠蛋白链合成减少或严重缺乏所引起的常染色体隐性遗传单基因疾病,是以β珠蛋白基因单核苷酸突变及小片段缺失为主要分子学基础。以该疾病作为研究对象,构建高特异性、高灵敏度、可用于低丰度基因单核苷酸突变及小片段缺失检测的技术,可为利用母体血浆中胎儿单基因遗传性疾病的检测寻求一种操作简单、成本低的新方法。
　　2004年Lo在Lancet报道应用等位特异性荧光定量PCR技术检测β地中海贫血小片段缺失突变CD41-42(del-CTTT)。但由于等位特异性PCR检测低丰度突变时敏感度不高,目前仍未应用于临床。近年有学者发现当引物3￠末端人为引入耐核酸酶外切的硫代磷酸修饰的碱基时,若引物3￠末端与模板不能完全匹配,具有3′→5′外切酶活性的高保真DNA聚合酶不能及时切除错配碱基,造成DNA聚合反应的非成熟性终止,阻止引物继续延伸,有效地减少了PCR在检测基因突变中常出现的假阳性结果。这一研究现已应用于部分单基因遗传性疾病临床样本的检测,但目前未见应用于低丰度基因突变的检测。
　　在前期实验中,以β-地中海贫血常见的两种单核苷酸突变位点为目标,利用常规PCR、LDR、毛细管电泳三者相结合的技术对所建立的地中海贫血胎儿母血浆 DNA实验模型进行检测,发现该方法灵敏度为1:10000,因此证明该方法能够满足自孕妇血浆检测胎儿父源性单核苷酸突变的要求。但因在此实验中的PCR产物需要经过纯化,而后再将纯化产物应用于下一步LDR反应中,在纯化过程中极易污染,直接影响实验结果的准确性。
　　在本研究中,我们将高保真DNA聚合酶结合硫化修饰引物构成的“分子开关”与等位特异性实时定量PCR结合来检测低丰度β地中海贫血CD41-42(del-CTTT)突变,以期用于孕妇血浆中胎儿单基因疾病小片段缺失突变的检测。而对于基因单核苷酸突变的检测方法,我们将立足于前期实验基础之上进行简化实验步骤等改良,拟将PCR扩增产物直接应用于LDR反应后再进行毛细管电泳检测,不再进行纯化等繁杂的操作步骤,以期达到减少污染、节约成本的目的。
　　材料和方法:
　　1.DNA聚合酶结合普通引物与高保真聚合酶结合硫化引物分别进行常规PCR扩增β地中海贫血CD41-42(del-CTTT)突变基因片段全血基因组提取、引物退火温度测试[模板为正常基因组 DNA与CD41-42(del-CTTT)杂合突变基因组DNA]、扩增片段切胶回收后测序。
　　2.高保真DNA聚合酶结合硫化引物构成的“分子开关”结合等位特异性实时定量PCR检测β地中海贫血CD41-42(del-CTTT)突变基因片段
　　将CD41-42(del-CTTT)杂合突变基因组DNA稀释成各浓度梯度进行扩增检测,正常基因组DNA稀释成各浓度梯度作为对照。
　　3.利用甲基化敏感限制性酶切法结合实时定量PCR检测高甲基化RASSF1A片段以验证孕妇血浆DNA是否存在胎儿游离DNA。
　　采孕妇新鲜外周血5ml,制备血浆后提取孕妇血浆 DNA,限制性内切酶 Hinp1I和Hha I进行酶切后,实时定量PCR以RASSF1A为靶点检测胎儿游离DNA。
　　4.普通PCR、LDR、毛细管电泳技术相结合的改良方法检测低丰度单核苷酸突变基因
　　4.1提取人类基因组全血DNA后送公司测序证实突变基因类型。将20pgCD17(A→T)突变杂合子、IVS-Ⅱ-654(C→T)杂合子突变型基因组DNA分别和1ng、10ng、50ng、100ng的正常基因组DNA混合后建立β-地贫胎儿孕妇血浆模型,正常基因组DNA作为阴性对照。PCR扩增产物进行 LDR反应后结合毛细管电泳检测连接产物。计算灵敏度。
　　4.2检测正常孕妇血浆中的微量单核苷酸突变
　　正常孕妇血浆DNA中加入20pg单核苷酸突变杂合子外周血DNA后进行扩增、扩增产物电泳及LDR检测反应。
　　结果:
　　1.无3′→5′外切酶活性的DNA聚合酶结合普通引物进行PCR扩增、电泳检测产物后可见未明显体现等位特异性PCR扩增的温度特异性;有3′→5′外切酶活性的高保真聚合酶结合硫化引物进行PCR扩增、电泳检测产物后可见PCR扩增退火温度越高,特异性越好,至67.8℃时,可判读正常基因与CD41-42(del-CTTT)杂合突变基因。
　　2.将有3′→5′外切酶活性的高保真聚合酶与硫化引物构成的“分子开关”结合实时定量PCR进行检测,在β地中海贫血CD41-42(del-CTTT)杂合突变基因组DNA各浓度梯度中(分别为300ng、30ng、3ng、300pg、30pg)均可见明显扩增产物曲线;正常基因组DNA300ng扩增产物可被检出,其余各浓度梯度均未检测出明显扩增产物。
　　3.常规PCR、LDR反应、毛细管电泳技术相结合检测基因点突变的灵敏度
　　用自动测序分析仪检测,该技术可检测出以50ng正常基因组DNA中含有的20pgβ-地中海贫血杂合突变基因组DNA PCR扩增产物为模板的LDR产物,且产物峰面积与正常模板浓度成反比,检测灵敏度最高为1:5000,阴性对照经片段分析后未见LDR产物。
　　4.将酶切前后的孕妇血浆进行实时定量PCR检测,可见RASSF1A基因酶切前后可均被检出,且酶切后Ct值较酶切前延后2.28;β-actin基因作为对照酶切前可被检出,酶切后未被检出。
　　5.正常孕妇血浆基因组 DNA中加入单核苷酸突变杂合子外周血 DNA扩增产物的LDR检测反应结果,可见明显连接产物峰。
　　结论:
　　1.有3′→5′外切酶活性的高保真聚合酶与硫化引物构成的“分子开关”结合实时定量PCR有望用于孕妇血浆中胎儿DNA父源性小片段缺失突变的检测;
　　2.将PCR产物直接用于LDR检测的灵敏度能够满足检测母血浆中胎儿基因父源性单核苷酸突变检测要求。

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第一章 前言

第二章 高保真DNA聚合酶与硫化修饰引物建立的“分子开关”结合实时定量PCR在母体血浆胎儿β地中海贫血小片段缺失突变检测中的应用研究

2.1 材料和方法

2.2 结果

2.3 讨论

3.4 小结

第三章 PCR/LDR结合毛细管电泳技术检测孕妇血浆DNA中胎儿β地中海贫血单核苷酸突变

3.1 材料和方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 小结

全文小结

参考文献

文献综述

参考文献

研究生期间发表的文章

致谢