Dax1调控胚胎干细胞及诱导多能性稳态的分子机制

摘要

胚胎干细胞(ESCs)来自胚胎内细胞团，能通过体外培养保持自我更新和多能性。ESCs可以定向分化成包括免疫细胞在内的各种类型的细胞。阐明ESCs多能性及其稳态调控机制不仅可以推动组织工程、胚胎发育（包括免疫系统发育）、细胞定向分化及肿瘤等诸多领域的发展，也是革新诱导多能干细胞(iPSCs)技术的根本动力。
　　Nanog对控制ESC多能性及稳定状态发挥关键作用。然而，Nanog在ESCs中的表达呈异质性。Nanog的波动表达导致ESC多能性转录调节网络处于不断被破坏和重构的动态平衡，从而赋予ESCs不同的多能性状态。其中，Nanog高表达的(Nanoghigh)ESCs具有更高的自我更新效率，而Nanog低表达的(Nanoglow) ESCs倾向于准备分化。目前，对于Nanoghigh和Nanoglow ESCs如何在动态转变过程中稳定其多能性尚知之甚少。
　　Gata6是胚外内胚层(extra-embryonic endoderm，ExEn)发育的关键调控分子。然而，虽然Nanoglow或Nanog敲除的ESCs中Gata6表达上调，其自我更新能力和多能性却并未丢失，表明Nanog缺失导致的Gata6增高并不足以诱导ExEn分化。因此，必定存在其它与Nanog功能相似但相对独立的特异性转录因子，参与抑制了Nanoglow或Nanognull ESCs中Gata6的充分活化以及ExEn分化。
　　Dax1(dosage-sensitive sex reversal-AHC-critical region on the X-chromosome gene1,also known as Nr0b1)是转录抑制因子，属于孤儿核受体超家族成员。高通量蛋白及功能基因组学研究的结果表明，在以Oct4和Nanog为中心的蛋白相互作用网络中Dax1均是主要成员，三者共同参与构成ESC多能性核心转录调控网络，对下游靶基因的结合与转录调节具有高度的相关性。Dax1在ESCs中高丰度表达，并在分化后急剧下调。利用siRNA瞬时抑制ESCs内Dax1的表达导致产生ExEn样的细胞，提示Dax1可能对抑制ExEn分化发挥重要作用。然而迄今为止，Dax1与Nanog和Oct4的功能关系及其协同调控ESC自我更新与多能性的分子机制并不清楚。
　　本论文通过系统的基因和细胞功能实验围绕上述问题展开研究。取得以下主要研究结果:1）.稳定抑制(knockdown，KD) Dax1导致ESCs增殖减慢、产生分化样细胞并上调ExEn标记的表达。但Dax1 KD ESCs能够连续扩增并维持多能性基因的表达。体外分化和畸胎瘤实验结果表明Dax1 KD ESCs具有三胚层分化的能力。2）.在无滋养层和Lif的条件下，Dax1 OE ESCs仍能连续传代扩增，形成紧密的、碱性磷酸酶(AP)阳性的细胞集落，并保持较高的Oct4和Nanog表达水平，同时抑制各胚层标记的表达。3).Dax1直接结合Gata6启动子并抑制其转录活性;在Dax1 OE ESCs中过表达Gata6，导致细胞完全分化成ExEn类型的细胞。4).Dax1 KD/Nanog KD ESCs完全分化，提示共同干扰Nanog和Dax1显示累加效应。5).Dax1 OE不能完全阻止Nanog KD导致的ExEn标记的上调，反之亦然。在RA诱导分化条件下，Dax1 OE或Nanog OE均能有效阻止Gata6的表达，而Dax1 KD/Nanog OE和Nanog KD/Dax1 OE ESCs均不能完全抑制Gata6的表达。6）.Nanog KD导致Dax1+细胞表达Gata6，Dax1 KD使多数Nanog-细胞和极少量Nanog+细胞表达Gata6。7).Dax1 KD-Nanog:GFPlow细胞ExEn分化标志基因剧烈上调，并且很难存活或维持自我更新。Dax1 KD-Nanog:GFPhigh细胞可以产生Nanog:GFPlow细胞，但是Dax1KD-Nanog:GFPlow细胞不能产生Nanog:GFPhigh细胞。8）.重编程过程中，Dax1或NanogshRNA慢病毒感染的Oct4:GFP小鼠成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs）可以被重编程为表达SSEA-1和AP的细胞，但这些细胞后续不能激活Oct4:GFP报告载体和内源性Sox2和Rex1的表达。9).Dax1 OE或Dax1 KD不会影响Oct4的表达，而Oct4 KD或OE分别下调或上调ESCs内Dax1的mRNA水平。Oct4可以结合Dax1的启动子，而Dax1并不能结合Oct4基因座。10).Dax1OE不能阻止Oct4 KD诱导的细胞分化。但Dax1 OE可以部分逆转ExEn和滋养外胚层(Trophectoderm，TE)标志基因在Oct4缺失后的表达变化。11).Dax1 OE和Dax1 KD在Lif+和Lif-条件下均未影响Stat3和Erk1/2的磷酸化水平。
　　研究结论:1）.抑制Dax1的表达导致ESC自我更新能力降低，ExEn分化倾向性增强，但其多能性不会丧失。2）.过表达Dax1使ESCs具有LIF非依赖的自我更新能力。3).Dax1直接调控Gata6的转录表达。4).Dax1和Nanog协同沉默Gata6的表达，进而阻止ExEn分化。5).Dax1与Nanog在功能上相似但各自独立，能部分代偿但又不能完全相互代替。6).Dax1是Nanoglow和Nanoghigh ESCs动态转变的必要条件，其机制是抑制Nanoglow ESCs分化。7).Dax1和Nanog一样，是诱导体细胞重编程最终获得真正多能性的保证。8).Dax1可能不仅直接参与抑制ESCs向TE分化，还可能介导了Oct4对TE分化的部分调控功能。本论文的研究表明，ESCs及诱导多能性的稳定状态依赖Dax1和Nanog的双重保护，这些发现为进一步揭示ESCs命运决定机制、多能性的动态平衡规律和体细胞重编程机制提供了新线索。