MG53合成修饰障碍抑制烧伤后肌膜修复导致骨骼肌代谢紊乱的实验研究

摘要

目的:
　　观察烧伤后骨骼肌细胞膜完整性变化，探索MG53在烧伤后骨骼肌膜修复障碍中的作用及其分子机制。
　　方法:
　　一、体内实验:按随机数字表将216只雄性健康BALB/C小鼠随机分为正常对照(C)组，烧伤对照(B)组，烧伤+胰岛素治疗(Ⅰ)组。C组只给予麻醉和剃毛，37℃水9秒假烫伤;B、C组给予90℃水烫伤9秒，造成30％体表面积Ⅲ度烧伤。伤后各组均给予正常饮食及饮水，Ⅰ组于烧伤后6h（麻醉清醒后）皮下注射甘精胰岛素（5UI/kg.d），B组于烧伤后6h皮下注射等体积生理盐水，C组皮下注射等体积生理盐水，每天1次。观察伤前及伤后2、5、10和14天各项指标的变化。
　　（一）通过腹腔注射伊文思蓝(EBD)，检测肌细胞内EBD荧光强度和EBD含量，反映肌膜完整性;
　　（二）采用Treadmill实验和腹腔注射EBD，通过对比运动前后肌细胞内EBD荧光强度和EBD含量反映肌膜修复能力。采用机械分离和酶消化法，分离单条肌纤维。用紫外线破坏肌纤维膜，检测流入肌丝的FM1-43荧光强度以反映肌纤维膜的自我修复能力;
　　（三）采用甘油-3-磷酸激酶氧化(GK-GPO)法，测定甘油三酯(TG)含量;
　　（四）采用treadmill实验，检测小鼠小腿肌肉耐力;
　　（五）采用还原性免疫印迹(WB)法检测骨骼肌中MG53、蛋白二硫键异构酶(PDI)、CCAAT/增强子结合蛋白(CHOP)、腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK-a)、p-AMPK-a、胰岛素受体底物1(IRS-1)与细胞因子信号抑制物（SOCS-1和SOCS-3）蛋白含量;采用非还原性免疫印迹法检测MG53蛋白多聚体含量。
　　二、体外实验:体外培养小鼠骨骼肌前体细胞株C2C12，并诱导分化48h。
　　（一）实验分为正常对照(Control)组，胰岛素(INS)组，胰岛素+PI3K抑制剂(INS+LY294002)组。分别采用多聚酶链式反应(PCR)和免疫印迹(WB)法检测MG53 mRNA和蛋白的表达量;
　　（二）实验分为正常对照(Control)组，腺苷酸激活蛋白激酶激动剂(AICAR)组。分别采用多聚酶链式反应(PCR)和免疫印迹(WB)法检测MG53 mRNA和蛋白的表达量;
　　（三）建立烧伤微环境模型，实验分为正常对照组（Control）组，烧伤血清组(BS)，烧伤血清+STAT抑制剂(BS+S3I-201)组。采用免疫印迹(WB)法和免疫荧光(IF)法检测C2C12细胞中IRS-1、SOCS-1和SOCS-3蛋白表达的变化。
　　结果:
　　1.烧伤后骨骼肌膜完整性的变化及胰岛素对其的影响。与正常对照组相比，伤后第14天腓肠肌中EBD含量显著升高(P＜0.05)。与烧伤对照组相比，胰岛素治疗组小鼠腓肠肌中EBD含量有所减少(P＜0.05)。
　　2.烧伤后骨骼肌膜自我修复功能的变化及胰岛素对其的影响。与正常对照组相比，烧伤对照组小鼠伤后第14天运动后腓肠肌中EBD明显增加(P＜0.05)。与正常对照组相比，烧伤对照组小鼠伤后第14天肌纤维内FMI-43明显增加(P＜0.05)。与烧伤对照组相比，胰岛素治疗组小鼠运动前后腓肠肌中EBD增量显著降低(P＜0.05)，肌纤维内FMI-43含量显著降低(P＜0.05)。
　　3.烧伤后骨骼肌重量，脂质沉积和耐力的变化及胰岛素对其的影响。与正常对照组相比，烧伤对照组小鼠伤后第5、10和14天小鼠腓肠肌重量明显降低(P＜0.05)，伤后10、14天腓肠肌中TG明显升高(P＜0.05)，伤后2、5、10和14天小腿肌耐力均明显降低(P＜0.05);与烧伤对照组相比，胰岛素治疗组小鼠腓肠肌重量，TG含量有所降低(P＜0.05)，小腿肌耐力有所增加(P＜0.05)。
　　4.烧伤后骨骼肌中MG53表达和多聚化的变化及胰岛素对其的影响。与正常对照组相比，烧伤组小鼠在伤后14天腓肠肌中MG53表达显著降低(P＜0.05)。烧伤组小鼠伤后5、10和14天腓肠肌中MG53多聚体显著减少(P＜0.05)。与烧伤对照组相比，胰岛素治疗组烧伤小鼠伤后14天腓肠肌中MG53表达明显升高(P＜0.05)，伤后5天腓肠肌MG53多聚体明显增加(P＜0.05)，而伤后10和14天MG53多聚体无明显变化(P＞0.05)。
　　5.烧伤后骨骼肌中内质网应激标签蛋白PDI、CHOP表达变化及胰岛素对其的影响。与正常对照组相比，烧伤组小鼠伤后5、10和14天腓肠肌中PDI表达显增加(P＜0.05)。烧伤组小鼠伤后5、10和14天腓肠肌中CHOP显著增加(P＜0.05)。与烧伤对照组相比，胰岛素治疗组小鼠腓肠肌中PDI和CHOP表达无明显差异(P＞0.05)。
　　6.胰岛素通过胰岛素信号通路促进MG53合成，AICAR对MG53合成无明显影响。与正常对照组相比，胰岛素可使C2C12中MG53 mRNA水平和蛋白表达明显升高(P＜0.05)。与胰岛素组相比，胰岛素+PI3K抑制剂作用下，C2C12中MG53 mRNA水平和蛋白表达明显降低(P＜0.05)。与正常对照组相比，AICAR组C2C12中MG53mRNA水平和蛋白表达无明显变化(P＞0.05)。
　　7.烧伤后骨骼肌AMPK-a、p-AMPK-a、 IRS-1、SOCS-1和SOCS-3表达变化。与正常对照组相比，烧伤组小鼠腓肠肌中在烧伤后2-14天AMPK-a、p-AMPK-a表达均降低(P＜0.05);烧伤组小鼠腓肠肌中在烧伤后2-14天IRS-1表达均降低(P＜0.05);烧伤后2、5和10天腓肠肌中SOCS-1表达明显升高(P＜0.05)，SOCS-3在烧伤后10、14天显著升高(P＜0.05)。
　　8.烧伤后血清刺激下C2C12中SOCS-1、SOCS-3和IRS-1表达变化，及SOCS对IRS-1表达的影响。与正常对照组相比，在烧伤血清作用下C2C12中SOCS-1和SOCS-3表达明显升高，而IRS-1明显减低(P＜0.05);与烧伤血清组相比，烧伤血清+抑制剂S3I-201组C2C12中SOCS-1和SOCS-3表达明显降低(P＜0.05)，而IRS-1表达明显升高(P＜0.05)。
　　结论:
　　1.严重烧伤后肌膜自我修复功能障碍引起的肌膜破损是骨骼肌萎缩、无力和脂质沉积的重要原因。
　　2.烧伤后骨骼肌中MG53表达缺陷和寡聚化异常是肌膜自我修复功能障碍的主要原因。
　　3.烧伤后骨骼肌中SOCS激活引起的SOCS-1、SOCS-3表达升高可导致IRS-1降解，产生胰岛素抵抗，与伤后骨骼肌中MG53缺乏密切相关。
　　4.烧伤后骨骼肌中内质网应激(ERS)引起PDI功能异常是导致MG53寡聚化障碍的重要原因。
　　5.胰岛素治疗可适度提高烧伤后肌膜自我修复能力。

目录

声明

缩略语表

摘要

前言

材料与方法

实验方法

结果

讨论

小结

全文总结

参考文献

附录

文献综述 重症烧伤后骨骼肌萎缩机制的研究进展

攻读硕士期间发表的论文

致谢