钙敏感受体在胃癌发生发展和十二指肠HCO3-分泌中的作用及其机制研究

摘要

目的:
　　钙是细胞内重要的第二信使，参与了众多病理生理过程的调控。G蛋白偶联受体C家族的钙敏感受体(CaSR)作为体内钙平衡重要的调节器，在整个消化系统均有表达，并且也在胃肠道生理功能和疾病进程中扮演着重要角色。目前有研究报道CaSR能通过钙信号途径影响胃酸、胰岛素分泌及营养吸收等生理过程;而高钙饮食可以激活CaSR，不但能抑制结肠癌的发展，还可以增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性;同时CaSR也在治疗腹泻疾病和结石相关性胰腺炎中具有潜在的调控作用。然而CaSR在胃肠道的功能及调控机制仍有很多盲区。众所周知消胃肠道肿瘤及消化性溃疡都是消化系统常见病。胃肠道肿瘤发病率高，且侵袭、转移能力强，多年来人们一直致力消化系统肿瘤细胞恶性转化以及后期浸润、转移的机制研究，但仍有许多问题仍不十分清楚;而消化性溃疡的复发与迁延不愈同样也是临床上治疗的一个难点。既往研究证实CaSR在不同的肿瘤中作用不同，而消化系统中仅在大肠癌中报道其作为抑癌因素，同时CaSR对胰腺碳酸氢盐(HCO3-)分泌的促进作用提示其可能也参与了十二指肠粘膜屏障的维护，因此本研究希望从消化生理和病理两方面，探讨钙敏感受体及其下游的钙信号通路在胃癌发生发展及十二指肠碳酸氢盐分泌中的作用及其相关机制，为以钙敏感受体及离子通道为靶点的药物研发提供重要的理论依据。
　　方法:
　　第一部分:钙敏感受体(CaSR)在胃癌发生发展中的作用及其机制研究
　　1、采用Real-time PCR、免疫组化及Western-blot技术检测胃癌及癌旁组织、正常胃粘膜永生化细胞系及胃癌细胞系中CaSR的表达，分析统计CaSR表达水平和临床分期、分型、血钙水平及预后的相关性;
　　2、采用CCK8增殖测定实验、细胞平面划痕实验，Transwell小室侵袭实验以及裸鼠皮下成瘤实验从体内外水平共同验证CaSR对胃癌细胞行为影响;
　　3、动态离子测定成像系统检测正常胃粘膜永生细胞与胃癌细胞CaSR活化后调控细胞内Ca2+及胃酸H+分泌能力的差异，从功能角度揭示CaSR从正常向胃癌发展中的角色转变;
　　4、Western-bolt技术检测正常胃粘膜永生细胞与胃癌细胞CaSR活化后下游相关信号通路变化的差异，筛选最为重要的信号通路及靶基因。
　　第二部分:钙敏感受体(CaSR)通过Ca2+调控途径促进十二指肠离子转运及HCO3-分泌的研究
　　1、Western-blot和免疫组化技术检测CaSR在小鼠十二指肠组织及细胞系的表达及分布情况;
　　2、动态离子测定系统检测CaSR对十二指肠上皮细胞内Ca2+变化及HCO3-分泌的影响;
　　3、通过各种离子通道抑制剂从细胞水平验证参与CaSR调控HCO3-分泌的功能机制及下游相关通路。
　　结果:
　　第一部分:钙敏感受体(CaSR)在胃癌发生发展中的作用及其机制研究
　　1、Western-blot，Real-time PCR和免疫组化结果证实CaSR在胃癌组织和胃癌细胞系中的表达明显高于癌旁组织和正常胃粘膜永生化细胞系，并且CaSR的表达量与胃癌大小和分化程度、分期均有相关性（p＜0.05）;
　　2、临床资料统计胃癌病人血液中的钙离子浓度与CaSR蛋白表达量呈正相关，生存分析表明CaSR低表达组的胃癌患者术后生存时间优于CaSR高表达组（p＜0.01），提示CaSR与胃癌病人的预后呈负相关性;
　　3、激活CaSR能促进胃癌细胞MKN45、SGC-7901的增殖、迁移及侵袭能力(P＜0.05)，并且这种促癌能力与CaSR的表达水平呈正相关。虽然CaSR对正常胃粘膜永生细胞GES-1细胞也有一定的促迁移作用，但对增殖无明显影响，CaSR的抑制剂NPS2143及CaSR shRNA能逆转CaSR对胃癌细胞增殖、迁移及侵袭的促进作用(p＜0.05);
　　4、裸鼠皮下成瘤实验证实CaCl2瘤内注射激活CaSR，可以促进裸鼠皮下肿瘤的生长，而CaSR抑制剂NPS2143能够阻断CaSR的促成瘤作用（p＜0.05）;
　　5、功能机制研究发现GES-1正常胃粘膜永生细胞、MKN45及SGC-7901胃癌细胞的CaSR均能调控细胞内钙增加，并且胃癌细胞MKN45及SGC-7901细胞内钙升高的幅度较正常胃粘膜永生细胞GES-1明显上升，提示正常细胞与癌细胞之间CaSR的钙调控能力及途径存在差异(p＜0.001); CaSR抑制剂NPS2143及CaSR shRNA能阻断MKN45胃癌细胞CaSR活化引起的细胞内钙变化（p＜0.05）;
　　6、无外钙环境中CaSR的活化并不能引起细胞内钙变化，必须在有钙环境中CaSR才能调控细胞内钙水平，膜上钙通道阻断剂2-APB和PLC途径阻断剂均能完全阻断CaSR对细胞内钙的影响，提示参与CaSR调控胃癌细胞内钙增加的主要机制是外钙内流途径（p＜0.05）;
　　7、分子机制研究证实，同时激活GES-1正常胃粘膜永生细胞和MKN45、SGC-7901胃癌细胞的CaSR，下游MAPK(ERK1/2/JNK)信号通路均在5-10min明显活化，但PI3K/AKT和Wnt/β-catenin通路的变化却出现了差异， GES-1细胞的PI3K/AKT和Wnt/β-catenin信号通路被逐渐抑制，而MKN45、SGC-7901细胞却明显活化，提示正常细胞与癌细胞之间上述两条通路的变化存在差异，并且可能与细胞内钙变化幅度的不同相关;
　　8、细胞内钙螯合剂BAPTA-AM能完全阻断CaSR对PI3K/AKT和Wnt/β-catenin以及MAPK信号通路的活化作用，提示Ca2+信号的确是精确调控上述通路的关键因素;PI3K/AKT、Wnt/β-catenin的抑制剂和细胞内钙螯合剂BAPTA-AM均能逆转CaSR促进胃癌细胞增殖、迁移及侵袭的能力;
　　第二部分:钙敏感受体(CaSR)通过Ca2+调控途径促进十二指肠离子转运及HCO3-分泌的研究
　　1、免疫组化及蛋白免疫印迹实验证实C57BL/6小鼠十二指肠组织、狗的十二指肠上皮细胞SCBN以及人的大肠癌细胞SW480、Caco-2均有CaSR表达，十二指肠组织主要在绒毛上皮顶端及基底部广泛表达，进一步亚细胞定位是在细胞的胞浆、胞膜区域;
　　2、功能实验发现十二指肠上皮细胞SCBN的CaSR能够调控细胞内钙增加，并且增加的幅度与激动剂的刺激浓度呈剂量依赖性(p＜0.01）。CaSR阻断剂Calhex后能明显阻断CaSR介导的细胞内钙变化(p＜0.05）;
　　3、无外钙环境中激活SCBN细胞的CaSR并不能引起细胞内钙增加，必须在有钙环境中CaSR才能调控细胞内钙水平，膜上钙通道阻断剂2-APB和SKF能完全阻断CaSR对SCBN细胞内钙的影响，提示CaSR对SCBN细胞的钙调控机制是通过外钙内流途径是(p＜0.05);
　　4、进一步单细胞HCO3-动态测定实验发现SCBN细胞的CaSR可以通过影响细胞内钙变化，调控HCO3-分泌通道CFTR的开放促进了HCO3-的跨膜流动，CFTR阻断剂CFTR-173及膜上Ca2+通道阻断剂2-APB均能阻断CaSR对HCO3-跨膜流动的促进作用（p＜0.01）;
　　5、动物体内实验结果提示CaSR的活化对CFTR野生型小鼠的十二指肠粘膜HCO3-分泌具有促进作用(p＜0.01)，但对CFTR敲除小鼠HCO3-的分泌没有影响，另外对代表Cl-通道活性的Isc值也没有调控作用(p＞0.05); PLC-Ca2+途经抑制剂U73122可以明显阻断CaSR对CFTR野生型小鼠HCO3-的促分泌作用（p＜0.01）;
　　结论:
　　1、本研究首次证实了CaSR在胃癌发生发展中的促癌作用及其相关机制，CaSR通过膜上钙通道介导了胃癌细胞内钙的增加，进而激活下游的PI3K/AKT和3-catenin信号通路促进胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力。并且CaSR的表达水平及其介导的细胞内钙变化幅度是调控胃癌细胞行为及其下游信号通路活化差异的重要因素。我们的结果不仅为临床上高钙血症的不良预后给出了可能的解释，同时也为低钙补液、低钙饮食防治胃癌的理论和以CaSR为靶点的药物研发提供实验依据;
　　2、我们生理功能的研究结果发现CaSR具有促进十二指肠HCO3-的分泌、帮助粘液屏障构建的重要作用。十二指肠上皮细胞的CaSR通过钙调控途径，不仅激活了HCO3-分泌通道CFTR，同时还活化了为HCO3-分泌提供驱动力IKCa（Ca2+激活钾通道）通道共同促进HCO3-的分泌，而Cl-通道没有受CaSR/Ca2+途径的调控，推测十二指肠上皮HCO3-与Cl-的分泌存在不同的调节机制。该研究不仅有助于治疗囊性纤维化病人HCO3-的分泌缺失，还可能为以CaSR和离子通道为靶点的粘膜屏障促进药物提供一定的理论依据。

目录

声明

缩略词表

摘要

第一部分 钙敏感受体在胃癌发生发展中的作用及其机制研究

第一章 前言

第二章 钙敏感受体在人胃癌组织及胃癌细胞系中的表达变化

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 钙敏感受体对胃癌细胞生物学行为的影响

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 实验结果

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 钙敏感受体促进胃癌进展的机制研究

第一节 功能机制研究：正常胃粘膜永生细胞及胃癌细胞钙敏感受体调控细胞内Ca2+变化及H+分泌的功能存在差异

第二节 分子机制研究：正常胃粘膜永生细胞及胃癌细胞钙敏感受体活化调控下游信号通路活化的差异

参考文献

第二部分 钙敏感受体通过Ca2+调控途径促进十二指肠离子转运及碳酸氢盐分泌的研究

第一章 前言

第二章 钙敏感受体在十二指肠组织及细胞系的表达分布

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 十二指肠上皮细胞的钙敏感受体具有调节细胞内Ca2+变化的功能

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 钙敏感受体通过Ca2+调控途径促进了十二指肠离子转运及碳酸氢盐分泌

第一节 细胞水平验证钙敏感受体活化对十二指肠上皮细胞SCBN碳酸氢跨膜流动的促进作用

第二节 体内实验证实钙敏感受体对十二指肠上皮细胞SCBN碳酸氢分泌的促进作用

参考文献

文献综述(已发表)

攻读博士学位期间发表的论文、申请的基金及专利

致谢