肿瘤相关巨噬细胞CGI-58在结肠癌恶性进展中的作用研究

摘要

结直肠癌是一种常见的消化道恶肿瘤，其发病率在其他恶性肿瘤中排名第三[1]。像其他实体瘤一样，肿瘤的发生发展与多种炎性细胞的介导相关，其中也包括了巨噬细胞[2，3]。新近报道称，浸润在肿瘤组织中的巨噬细胞称为肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)[4，5]。肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)活化介导的炎性微环境在肿瘤恶性进展过程中起重要作用。炎性因子促进肿瘤的发展在以往的研究中较多，然而新近研究表明间质细胞的代谢重编程在调节肿瘤生物学中起着至关重要的作用[6-8]。CGI-58，又名ABHD5，是一种新发现的促进脂肪分解的辅酶，广泛表达于人体各个组织器官中。我们在免疫组化和巨噬细胞-结肠癌细胞共培养体系的实验中发现，CGI-58的表达在肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)中是明显升高的。我们运用本实验室巨噬细胞-结肠癌细胞共培养体系，特异性敲低巨噬细胞CGI-58和过表达巨噬细胞CGI-58，并运用体内和体外实验证明了巨噬细胞CGI-58在结肠癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响，揭示了巨噬细胞CGI-58对结肠癌恶性进展的影响。同时我们进一步用Western blot和Real-time PCR法来探讨其可能的机制，发现巨噬细胞在CGI-58缺失的情况下，可抑制FOXO1的磷酸化，进而增强其转录活性，促进IL-1β的表达。我们的研究以肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)脂质代谢异常为切入点，率先解析肿瘤相关巨噬细胞(TAMs) CGI-58在慢性炎症和结肠癌恶性进展的中的作用，研究结果对于从肿瘤微环境角度寻找结肠癌的有效防治策略有重要指导意义。
　　目的:
　　研究肿瘤相关巨噬细胞在CGI-58在结肠癌恶性进展中所起的作用。
　　方法:
　　1.CGI-58在肿瘤相关巨噬细胞中的表达
　　为了研究结肠癌中的脂代谢重编程与肿瘤相关巨噬细胞的关系，我们运用免疫组化的方法来检测人类结肠癌及癌旁组织和小鼠结肠癌及癌旁组织，并根据Remmele和stegner提出的免疫反应评分（Immunoreactive Score简称IRS）来评价免疫组化染色的情况，观察CGI-58在肿瘤相关巨噬细胞的表达情况。在细胞水平上，我们运用小鼠结肠癌细胞系CT26和MC38的条件上清液来处理巨噬细胞RAW2647，并用正常培养基处理的RAW2647来做对照，用western blot和Realtime PCR法来检测不同处理条件下CGI-58的表达情况。
　　2.肿瘤相关巨噬细胞CGI-58促进结肠癌细胞的恶性进展
　　为了进一步研究肿瘤相关巨噬细胞CGI-58在结肠癌进展中的作用，我们采用慢病毒介导的基因稳定敲低或升高RAW264.7中的CGI-58表达，Western blot分析实验结果及使用药物进行稳定转染细胞株的筛选，以获得稳定的细胞克隆株。
　　在体外实验中，分别用收取巨噬细胞条件培养基、巨噬细胞CGI-58敲低组条件培养基和巨噬细胞CGI-58过表达组条件培养基来处理小鼠结肠癌细胞CT26，并分别运用CCK-8、细胞周期、细胞凋亡AnnexinⅤ FITC、克隆形成实验来检测肿瘤相关巨噬细胞CGI-58是否影响结肠癌的进展。
　　体内实验中，我们将BABL/C小鼠用CT26细胞系接种上皮下瘤，并分别用巨噬细胞条件培养基和巨噬细胞CGI-58敲低组条件培养基、巨噬细胞条件培养基和巨噬细胞条件培养基巨噬细胞CGI-58高表达组条件培养基来皮下注射瘤周，并观察肿瘤的大小。
　　3.巨噬细胞CGI-58促进结肠癌细胞恶性增殖的机制初探。
　　我们将巨噬细胞CGI-58高表达组、巨噬细胞CGI-58缺失组、正常巨噬细胞组及加入FOXO1的抑制AS1842856剂处理的巨噬细胞组，利用western blot和RealtimePCR法来检测巨噬细胞CGI-58对IL-1β和FOXO1的表达调控。
　　结论:
　　1.在免疫组化实验中，CGI-58的表达量在肿瘤相关巨噬细胞ATMs中明显地高于癌旁巨噬细胞。用小鼠结肠癌细胞系CT26、MC38条件培养基处理的巨噬细胞与正常培养基处理的巨噬细胞比较，其CGI-58的表达水平更高。我们得出结论CGI-58的表达在肿瘤相关巨噬细胞TAMs中升高的，CGI-58可能在脂质聚集较多的TAMs起到了分解作用。
　　2.巨噬细胞CGI-58敲低条件培养基处理小鼠结肠癌细胞CT26，较巨噬细胞条件培养基，其肿瘤细胞增殖明显降低、细胞周期的G1期增加、克隆形成率较低，而巨噬细胞CGI-58高表达组结果相反。在皮下瘤瘤模型中，我们统计发现用巨噬细胞CGI-58敲低组条件培养基处理的皮下瘤体积较对照巨噬细胞条件培养基处理组小，小鼠的存活率更高。我们可以得出结论，肿瘤相关巨噬细胞CGI-58缺失的情况下可以抑制结肠癌的恶性进展。
　　3.巨噬细胞CGI-58敲低组较之对照组，IL-1β表达明显上调，FOXO1的磷酸化水平降低，提示FOXO1转录激活;而先前研究表明，FOXO1可调控IL-1β的转录表达，因此我们推测CGI-58缺失可能通过激活FOXO1蛋白转录活性而促进IL-1β的mRNA水平。而在肿瘤相关巨噬细胞中，CGI-58表达升高，我们猜测:CGI-58/FOXO1通路可介导M2型巨噬细胞形成，发挥促瘤效应。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 CGI-58在肿瘤相关巨噬细胞中的表达升高

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

第三章 肿瘤相关巨噬细胞CGI-58升高促进结肠癌细胞的恶性增殖

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

第四章 巨噬细胞CGI-58促进结肠癌细胞恶性增殖的机制初探

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

全文结论

参考文献

文献综述 肿瘤相关巨噬细胞在结直肠癌中的作用

攻读硕士期间发表论文情况

致谢