GCaMP基因工程化C17.2神经干细胞生物学特性的初步研究

摘要

研究背景:
　　视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)是一组遗传性视网膜变性疾病，缺乏有效干预手段，成为主要的视力障碍或失明原因。干细胞移植治疗RP具有良好前景，其治疗作用可能是通过旁分泌以及细胞替代作用改善视功能，但细胞旁分泌及细胞替代作用具体机制不清。需要一种有效的研究手段，能够对移植的干细胞定位示踪并进行机制研究。GCaMP作为一种基因编码钙离子指示剂(genetically encoded calcium indicator,GECI)，能够稳定表达在细胞内，结合游离钙离子发出绿色荧光，对细胞进行示踪并监测细胞内游离钙离子活动，可用于信号转导通路和机制研究。C17.2神经干细胞来源于小鼠小脑，经过永生化处理，性质稳定，可以用于干细胞移植治疗研究。皇家外科学院大鼠（RCS大鼠）是经典的慢性视网膜色素变性模型，应用于干细胞移植治疗RP研究。
　　目的:
　　通过慢病毒转染后流式细胞筛选，构建稳定表达GCaMP钙离子指示剂的C17.2-GCaMP细胞。对C17.2-GCaMP细胞进行干性、分化、增殖、凋亡的性质鉴定，体外检测C17.2-GCaMP钙离子成像，并对C17.2-GCaMP细胞RCS大鼠网膜下移植治疗研究进行初步探讨，为干细胞移植治疗RP的示踪及机制研究提供前期研究基础。
　　方法:
　　第一部分:GCaMP基因工程化的C17.2神经干细胞的构建
　　1.进行C17.2神经干细胞的培养，用携带GCaMP5基因的慢病毒转染C17.2细胞，流式筛获得转染后GCaMP阳性细胞。
　　2.将GCaMP阳性的C17.2细胞以1-2个细胞每孔的密度接种于96孔板，扩增后得到C17.2-GCaMP细胞，并在荧光显微镜下检验荧光表达。
　　3.相同方法得到C17.2-GFP细胞，用于C17.2-GCaMP细胞的对照研究。
　　第二部分:GCaMP基因工程化的C17.2神经干细胞的鉴定
　　1.用免疫荧光及qPCR检测C17.2、C17.2-GFP、C17.2-GCaMP细胞中巢蛋白(nestin)的表达。
　　2.细胞分化实验检验C17.2、C17.2-GFP、C17.2-GCaMP细胞分化能力。
　　3.通过细胞增殖实验及细胞周期实验检测C17.2、C17.2-GFP、C17.2-GCaMP细胞的增殖能力，qPCR检测P27的mRNA表达。
　　4.Tunel染色检测C17.2、C17.2-GFP、C17.2-GCaMP细胞凋亡情况。
　　5.C17.2-GCaMP细胞钙离子荧光成像检测，并与C17.2细胞Fluo-4 AM染色钙离子成像进行比较。
　　第三部分:GCaMP基因工程化的C17.2神经干细胞移植治疗RCS大鼠初步研究
　　1.将C17.2-GCaMP细胞移植到21天RCS-P+大鼠（实验鼠，以下简称RCS大鼠）视网膜下腔，移植后4周、6周免疫荧光染色观察C17.2-GCaMP细胞的分布、存活情况及视网膜内外核层厚度变化。
　　结果:
　　第一部分:构建了GCaMP基因工程化的C17.2神经干细胞
　　1.携带GCaMP5基因的慢病毒转染C17.2细胞流式筛选后获得GCaMP阳性细胞。
　　2.1-2个GCaMP阳性细胞扩增传代得到稳定表达GCaMP的C17.2-GCaMP细胞，且在荧光显微镜下能够呈现绿色荧光。
　　3.同样步骤获得C17.2-GFP细胞。
　　第二部分:GCaMP基因工程化的C17.2神经干细胞的鉴定
　　1.C17.2、C17.2-GFP、C17.2-GCaMP三种细胞Nestin免疫荧光染色均呈阳性，qPCR结果显示三种细胞Nestin mRNA表达无显著差异，表明C17.2-GCaMP细胞具有神经干细胞干性。
　　2.C17.2、C17.2-GFP、C17.2-GCaMP三种细胞能够分化。表明C17.2-GCaMP细胞具有分化成神经元和胶质细胞的潜能。
　　3.细胞增殖实验显示C17.2-GCaMP细胞增殖速率低于C17.2、C17.2-GFP细胞，细胞周期实验结果支持增殖实验结果，且C17.2-GCaMP细胞的细胞周期抑制因子P27mRNA表达较C17.2细胞增多，提示GCaMP基因在C17.2细胞内表达可能会减慢细胞增殖速率。
　　4.Tunel染色检测显示C17.2、C17.2-GFP、C17.2-GCaMP三种细胞无明显凋亡，提示C17.2-GCaMP细胞增殖速率的减慢并非由凋亡引起。
　　5.C17.2-GCaMP细胞能够呈现钙离子荧光成像，与Fluo-4 AM染色C17.2细胞比较，钙离子spike波形（锐波）增强，wave波形（慢波）不典型，这种差别可能由GCaMP在细胞内的长程表达引起。
　　第三部分:GCaMP基因工程化的C17.2神经干细胞移植治疗RCS大鼠的初步研究
　　1.C17.2-GCaMP细胞RCS大鼠视网膜下移植后，4周、6周后仍能存活，且向视网膜外核层和内核层迁移，细胞移植区域视网膜外核层和内核层均较非移植区域增厚，提示移植的细胞对感光细胞具有保护作用。
　　结论:
　　1.率先成功构建了C17.2-GCaMP细胞系。
　　2.C17.2-GCaMP细胞能够保持神经干细胞干性，能够分化为神经元和胶质细胞，未出现明显凋亡现象。尚未见文献报道。
　　3.首次发现:C17.2-GCaMP细胞增殖速率较C17.2、C17.2-GFP细胞降低，同时C17.2-GCaMP钙离子成像与Fluo-4 AM染色C17.2细胞成像比较存在差异，可能与GCaMP在细胞内长程稳定表达有关。
　　4.C17.2-GCaMP细胞在RCS大鼠网膜下移植后能够存活及示踪，且向网膜内层迁移，细胞移植区域视网膜内外核层增厚，提示C17.2-GCaMP细胞能够保护感光细胞延缓视网膜色素变性进程。为进一步研究干细胞移植治疗视网膜变性疾病的机制提供了新的手段。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 构建GCaMP基因工程化C17．2神经干细胞

2．1 引言

2．2 实验材料和仪器

2．3 实验方法

2．4 实验结果

2．5 讨论

2．6 小结

第三章 鉴定GCaMP基因工程化C17．2神经干细胞

3．1 引言

3．2 C17．2-GCaMP细胞的干性、分化、增殖、凋亡鉴定

3．3 C17．2-GCaMP细胞钙离子成像检测

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 GCaMP基因工程化的C17．2细胞移植治疗RCS大鼠的初步研究

4．1 引言

4．2 实验材料和仪器

4．3 实验方法

4．4 实验结果

4．5 讨论

4．6 小结

全文结论

参考文献

文献综述 GCaMP基因编码钙离子指示剂的研究进展及应用

攻读硕士期间研究成果

致谢