雌激素上调错配修复基因MLH1抑制结肠癌细胞增殖的研究

摘要

目的：
　　人DNA错配修复(mismatch repair, MMR)系统在维持基因组稳定性中起着关键作用。MMR功能障碍导致的微卫星不稳定（microsatellite instability, MSI）与许多恶性肿瘤的发生有密切关系，例如Lynch综合征。此外，约15％的散发性结直肠癌(colorectalcancer, CRC)也与MMR功能障碍相关。流行病学调查数据证实雌激素替代治疗对结直肠癌患者具有保护性作用。我们的前期研究表明，雌激素的这一作用可能与DNA错配修复蛋白MLH1有关。MLH1是体内最重要的MMR基因之一。然而，雌激素如何调节错配修复基因MLH1表达的具体机制尚不清楚。本研究旨在探讨雌激素诱导MLH1表达的机制，以及通过雌激素信号通路途径诱导MLH1表达对结直肠肿瘤增殖的影响。
　　第一部分 雌激素诱导MLH1表达的机制研究
　　我们的前期研究结果表明，围绝经期女性的结肠上皮细胞内源性MLH1蛋白表达水平与体内血清雌激素浓度呈正相关关系，但其MSH2蛋白表达与血清雌激素浓度无明显相关性。并且，体外研究发现雌激素可增强结肠上皮细胞内MLH1表达水平，但对MSH2蛋白表达影响非常有限。本研究旨在探讨雌激素诱导MLH1表达的作用机制。
　　方法：
　　1.在SW480、HT29和LoVo细胞中过表达雌激素受体α(ERα)和雌激素受体β(ERβ)，经由雌二醇(E2)或者牛血清结合的雌二醇(BSA-E2)处理，利用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative Polymerase Chain Reaction，RT Q-PCR)及蛋白质免疫印迹(Western Blot)方法从mRNA和蛋白质的水平分别检测MLH1的表达情况。
　　2.根据UCSC(www.geome.ucsc.edu)在线数据库分析MLH1基因转录起始位点，然后利用PCR方法从人基因组DNA中克隆MLH1基因近端启动子（-1953/+53），并插入到双荧光报告基因载体pGL3-Basic中，并命名为pGL3-Promoter-luc。然后运用荧光报告基因和染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)的方法检测MLH1基因启动子序列中是否存在雌激素应答元件。
　　结果：
　　1.E2在mRNA水平显著增强三种结肠癌细胞株的MLH1基因表达，但与之相比较，BSA-E2对该基因的表达影响非常微弱。此外，雌激素处理细胞的情况下，与对照组相比，过表达ERβ对MLH1在mRNA水平的表达上调具有协同作用(P＜0.001)。
　　2.我们发现MLH1近端启动子序列存在雌激素相关作用位点。并且，半雌激素应答元件与AP1结合位点在雌激素诱导MLH1表达的调控过程中都非常重要。
　　结论：
　　E2诱导MLH1表达是由ERβ介导，通过激活转录过程实现的。
　　第二部分 ERβ在体外和体内发挥抑制结直肠肿瘤生长的作用
　　据报道，ERβ特异性激动剂在体外和体内具有抑制增殖与诱导凋亡的作用。另一方面，绝经后雌激素替代治疗降低了微卫星低度不稳定及微卫星稳定型的结直肠癌发病风险。本研究旨在明确ERβ介导的MLH1表达上调是否能在体外和体内抑制结直肠癌细胞生长。
　　方法：
　　1.siRNA-shMLH1表达质粒转染SW480和Caco2细胞，同时伴随或不伴随ERβ过表达，然后分别与溶剂、雌激素或雌激素加ERβ特异性拮抗剂PHTPP孵育，并用5-FU处理细胞。最后用细胞计数试剂盒CCK-8检测细胞活性。
　　2.实验动物行双侧卵巢切除术，然后采用AOM/DSS诱导小鼠结直肠癌，并将实验动物分为2组，每5只一组。各组实验动物分别接受DPN（1 mg/kg/日）和等体积溶剂皮下注射。16周后采用颈椎离断法处死动物，取结直肠，称重并测量长度，计算重量/长度比值。
　　3.将HT29细胞(5×106)注射到已切除双侧卵巢的裸鼠皮下，并将实验动物分为3个组，每5只一组。各组实验动物分别接受DPN（1 mg/kg/日）、PHTPP（10-7 mol/日）和等体积溶剂皮下注射。使用以下公式对移植瘤体积进行监测:体积=1/2×（最大直径）×（最小直径）2。最终取部分移植瘤组织进行蛋白免疫印迹检测。
　　结果：
　　1.当细胞内源性MLH1蛋白表达被抑制，5-FU处理后细胞活性未显著降低。然而，过表达ERβ加E2处理，上调MLH1表达水平，从而增强细胞对5-FU的敏感性，细胞活性显著下降。
　　2.与溶剂注射组相比，DPN注射组的成瘤数量更少，结直肠平均重量/长度比值更小。
　　3.与溶剂注射组相比，DPN注射组的移植瘤平均体积和重量较前者小。同时，蛋白免疫印迹检测提示，DPN注射组移植瘤的MLH1蛋白表达水平显著高于对照组和PHTPP注射组。
　　结论：
　　ERβ通过上调MLH1表达，增强了细胞对5-FU的敏感性，并对实验动物体内结直肠肿瘤发生以及移植瘤细胞的生长起到抑制作用。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 雌激素诱导MLH1表达的机制研究

2．1 材料

2．2 方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 雌激素通过雌激素受体β上调MLH1表达并抑制结肠癌细胞增殖

3．1 材料

3．2 方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 小结

全文结论

参考文献

文献综述Ⅰ 中国人Lynch综合征研究进展

文献综述Ⅱ 结直肠癌研究模型

攻读博士学位期间取得的研究成果

致谢