Shox2基因转染犬骨髓间充质干细胞体外诱导分化培养与功能检测

摘要

背景和目的:
　　病窦综合征(sick sinus syndrome)是一种常见的严重威胁患者生命的缓慢性心律失常，临床无特效药物可以根治，主要治疗手段是植入人工电子起搏器。虽然电子起搏器的植入能有效改善症状、挽救患者生命，但仍存在许多问题:如应激状态下缺乏有效的生物反应性、电池使用时间有限、异物植入、外周电磁场干扰等。因此，当前心脏电生理领域研究的一大热点就是构建一种具有自主搏动能力的“生物心脏起搏器”，以取代电子起搏器。
　　超极化启动的环核苷酸门控通道(HCN)的基因亚型HCN4及其介导的起搏离子流(If)是窦房结细胞4期自动去极化形成的关键环节。既往研究表明，围绕HCN基因开展的重建生物起搏点的实验方法，都存在着移植后起搏功能退化或消失的现象。由此可见，仅仅重建If的离子通道无法
　　形成持久有效的生物起搏点。有研究发现参与胚胎心脏早期发育的矮小同源盒基因亚型2(Shox2)能够显著抑制Nkx2.5并有效上调HCN4的表达，是调控胚胎心脏细胞向窦房结细胞分化的关键因素。因此，利用Shox2作为转录调控因子诱导多能干细胞向窦房结样细胞分化，是生物起搏研究的一种理想选择。本研究在国家自然科学基金(81270246)资助下，将构建好的携带mShox2基因的慢病毒载体转染至骨髓间充质干细胞(MSC)后进行体外诱导分化，运用WB和膜片钳等实验方法对Shox2-MSCs进行相关的生理生化检查，以期探讨过表达Shox2基因的cMSCs作为一种生物起搏的“种子细胞”的可行性。
　　研究方法:
　　1.选取健康成年犬一只，麻醉后抽取骨髓，密度梯度离心法结合贴壁法分离培养cMSCs，倒置显微镜观察培养细胞的形态学特征，流式细胞仪鉴定。
　　2.根据NCBI小鼠Shox2 mRNA序列构建包装慢病毒载体pLentis-mShox2-RFP及pLentis-RFP，载体内携带嘌呤霉素抗药基因用于细胞纯化。
　　3.利用构建好的两种慢病毒载体转染cMSCs，并进行实验分组，将转染后的细胞与心肌细胞(CMs)，再利用嘌呤霉素纯化诱导后的cMSCs。
　　4.利用WB、实时定量PCR和免疫荧光技术检测实验组细胞Cx43/45、HCN4、Tbx3、Nkx2.5等心肌细胞特异性基因的表达情况。
　　5.全细胞膜片钳技术检测诱导分化后Shox2-cMSCs和对照组的离子流通道动力学特征。
　　结果:
　　1.采用密度梯度离心法结合贴壁法分离培养cMSCs，第3代可得到纯化的呈典型多边形或长梭形的细胞，胞体饱满，折光性好，具有良好的增殖能力和诱导分化潜能。流式细胞仪筛查，CD44和CD29高表达（93.2±3.6％），不表达CD34和CD45，符合MSCs特性。
　　2.在转染复数MOI=20的情况下，72 h后荧光显微镜下观察慢病毒对MSCs的转染效率可以达到（85±4.5）％(n=5）。慢病毒转染能力好，细胞生长活性未见明显改变。
　　3.取转染阳性的cMSCs行体外诱导分化后分为4组:A组(RFP-cMSCs组)、B组(RFP-cMSCs+CMs共培养组)、C组(Shox2-RFP-cMSCs组)、D组(Shox2-RFP-cMSCs+CMs共培养组)。
　　4.Shox2-RFP-cMSCs+CMs共培养组细胞经过共培养诱导分化后心脏传导系统特异性基因HCN4、Cx45、Tbx3的表达较其他组明显增加(P＜0.05)，而RFP-cMSCs+CMs共培养组细胞的Nkx2.5及Cx43的表达与其他三组相比明显增加。
　　5.全细胞膜片钳结果显示，Shox2-RFP-cMSCs+CMs共培养组细胞可以记录到超极化启动的内向电流，该电流具有明显的时间及电压依赖特性，且对Cs+敏感。根据记录到的尾电流重建该内向电流启动曲线和翻转电位，并进行计算，得到半数最大激活电压为-89.4±3.7mV，斜率为-16.3±1.5，翻转电位是-28.9±6.7mV。而仅转染RFP的RFP-cMSCs组和RFP-cMSCs+CMs共培养组细胞，未能记录到超极化启动的内向电流。
　　结论:
　　1.应用密度梯度离心结合贴壁法分离培养法，早期就可以得到纯化的MSCs，具有良好的增殖活性和多向分化潜能。
　　2.构建的慢病毒载体转染效率高，Shox2-MSCs组细胞稳定表达Shox2蛋白，有功能性HCN4通道出现。仅转染RFP的MSCs未能检测到HCN4蛋白。
　　3.Shox2-MSCs与CMs共培养诱导分化后，高表达Cx45、Tbx3及HCN4，符合心脏传导组织的表达特征。对照组细胞高表达Cx43、Nkx2.5，与工作心肌细胞表面标志物一致。
　　4.Shox2基因修饰的MSCs经诱导分化后，具备了起搏样细胞的电生理特征，可以记录到起搏离子流If，其检出率高于未经诱导分化的Shox2-MSCs。转RFP组和RFP-MSCs+CMs组细胞未记录到起搏离子流。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 犬骨髓间充质千细胞的分离培养及鉴定

2．1 材料和方法

2．2 结果

2．3 讨论

第三章 慢病毒载体构建、基因转染及体外诱导分化

3．1 材料和方法

3．2 结果

3．3 讨论

第四章 转染Shox2基因的cMSCs体外诱导分化后的功能检测

4．1 材料和方法

4．2 结果

4．3 讨论

全文总结

本研究的局限性

参考文献

文献综述

攻读硕士学位期间论文发表情况

致谢