转录因子TCF-1调控淋巴滤泡辅助T细胞的分化和功能的分子机制研究

摘要

目的：
　　B细胞活化后、历经克隆增殖、体细胞高频突变、抗体类别转化等过程最终分化成为浆细胞和记忆性B细胞，这些过程都需要CD4+T细胞的辅助。现在普遍认为，这些辅助B细胞的CD4+T细胞亚群，是一群因高表达CXCR5而在淋巴滤泡逗留的辅助T细胞，即淋巴滤泡辅助T细胞(Follicular Helper T cells，TFH)。TFH细胞的失调与多种疾病的发生相关，包括自身免疫性疾病、免疫缺陷、感染性疾病、肿瘤等。因此，研究TFH细胞的分化和功能，将为疫苗和佐剂的设计、疫苗使用的优化以及治疗TFH细胞失调引起的各种疾病提供更好的方向、靶点和策略，具有重要的科学意义和实用价值。
　　在LCMV病毒急性感染模型中，CD4+T细胞分化成为TFH细胞和TH1细胞，并分别发挥了辅助B细胞和CD8+T细胞的作用。活化的CD4+T细胞是如何分化成为这两种表型、功能完全不同的细胞亚群，是获得性免疫领域研究的重点。TFH细胞分化是一个多因素、多阶段的复杂过程。在一些关键分子的调控下，CD4+T细胞开启完全不同的基因表达模式，使得细胞向着不同的分化终点前进。其中，转录因子Bcl-6及Blimp1被认为是决定CD4+T细胞命运的关键分子。
　　Bcl-6是TFH细胞分化过程中的关键转录因子，而Blimp1是与Bcl-6相互拮抗的分子。它们之间的平衡决定了CD4+T细胞的分化。高表达Bcl-6的细胞最终分化为TFH细胞，而Blimp1可以促进细胞往non-TFH细胞方向分化。Bcl-6受到多种因素的调控。IL-6-STAT1， IL-12-STAT4和IL-21-STAT3通路都被报道能够诱导Bcl-6的表达;Batf也被认为是能够促进Bcl-6表达的上游转录因子。同时，Bcl-6能够受到Blimp1的负调控。
　　而本课题的研究对象TCF-1（由Tcf7基因编码），是一个在T细胞的发育、分化、功能以及记忆过程中都具有重要作用的转录因子。在T细胞发育过程中，TCF-1在发育的不同阶段具有显著不同的功能，受到Notch信号及WNT信号通路的调控。而在成熟的CD8+T细胞中，TCF-1影响活化CD8+T细胞分化命运，同时对于记忆细胞的分化及维持均具有重要意义。在CD4+T细胞中，已经证实TCF-1参与了TH1/TH2/TH17细胞的分化过程，是一个作用广泛的调控分子。有报道称TCF-1在TFH细胞中高表达而在TH1细胞中表达水平显著下降，暗示我们TCF-1在TFH细胞中应当具有重要的作用。
　　我们于是和本教研室叶丽林教授课题组共同开展了TCF-1在TFH细胞中的功能研究。我们利用TCF-1条件敲除小鼠、shRNA沉默系统、过表达系统以及TCF-1诱导敲除小鼠，在LCMV感染模型中，进行了一系列的表型研究。我们发现:感染后，TFH细胞高表达TCF-1、而TH1细胞中TCF-1表达水平很低，这种差异从感染后第2天持续到第8天。条件敲除或者shRNA沉默Tcf7，都能造成TFH细胞频率、数量、功能的缺陷，并最终影响B细胞分化及抗体水平。诱导敲除实验证实，TCF-1主要是在早期影响TFH细胞的分化;而对于成熟TFH细胞， TCF-1影响了TFH细胞对B细胞的辅助能力。
　　虽然我们已经证实了TCF-1对于TFH细胞分化及功能的重要性，但是TCF-1调控该过程的分子机制还并不清楚。在本研究课题中，我们通过Microarray、ChIP-PCR、CoIP等多种实验手段，筛选TCF-1调控调控TFH细胞分化及功能的下游靶基因，并揭示调控的详细机制。
　　方法和结果：
　　1.筛选TCF-1调控TFH细胞分化及功能的靶基因
　　我们分选了来自野生型以及Tcf7敲除小鼠感染后第8天的TFH细胞和TH1细胞。提取RNA，进行Microarray检测。Microarray数据显示:相比于正常TFH细胞，TCF-1缺失的TFH细胞中有569个基因表达下降，同时有513个基因表达上升。我们将这些变化的基因，与已发表文献中证实的TFH细胞分化相关基因进行GSEA分析。发现文献报道与促进TFH细胞分化相关的基因，在我们的正常TFH细胞样本组均高表达，而文献中与TH1细胞分化相关的基因，则在TKO来源的TFH细胞中表达上调。这说明，TCF-1的缺失，使得TFH细胞部分失去其应有的细胞表型，表现出TH1细胞的特征。这些被TCF-1调控与TFH细胞分化功能相关的基因包括Icos，Cxcr5,Ascl2,Il21，Il6st等，其中我们发现，TFH细胞分化的关键转录因子Bcl-6以及严重抑制TFH细胞分化的Blimp1，它们的基因表达也受到TCF-1影响。
　　2.TCF-1直接调控Bcl-6-Blimp1轴
　　分别构建了包含这两个调控元件的双荧光素酶报告基因质粒以及突变TCF-1保守结合位点的突变体。在293T细胞中转染质粒，双荧光素酶报告基因检测。结果显示，TCF-1保守结合位点被突变后，Bcl6 promoter相对荧光活性降低，而Prdm1regulator则表现出更高的相对荧光活性，反映出TCF-1通过直接结合到这些转录元件的保守结合位点，促进Bcl6启动子区域的转录活性、同时抑制Prdm1调控子区域的转录。接下来，我们在体内证实了这个结论，体内报告基因检测结果与体外基本一致，在TFH细胞中，TCF-1的调控作用更加明显。因此，我们认为TCF-1直接结合到Bcl6启动子促进其表达;结合到Prdm1调控子发挥抑制作用。TCF-1直接转录调控Bcl-6-Blimp1轴，它通过调节Bcl-6-Blimp1轴的平衡来决定CD4+T细胞分化命运。
　　3.TCF-1与Bcl-6相互作用影响TFH细胞功能
　　我们克隆了带有标签的Bcl-6、TCF-1 P33、P45亚型。将Bcl-6与TCF-1的不同亚型共转293T细胞，CoIP实验结果显示Bcl-6与P33、P45具有直接的相互作用。在内源CoIP中，我们在感染后第8天活化的CD4+T细胞中，用Bcl-6的抗体进行CoIP。在检测到Bcl-6明显富集的同时，也发现TCF-1 P33、P45亚型也出现在Pulldown产物里，进一步证实了Bcl-6-P33/P45相互作用。
　　共转Bcl-6、P45、B-catenin，结果显示B-catenin阻断Bcl-6与P45的结合。对于TFH细胞的分化来讲，B-catenin与P45的结合具有重要意义。导入ICAT质粒的SMARTA细胞，TFH细胞频率降低，这是因为ICAT干扰了β-catenin与P45的结合，导致P45不能完全发挥其转录功能。
　　共转Bcl-6、P33、Tle3，结果显示Tle3能够增强P33-Bcl-6相互作用。P33与Bcl-6的相互作用能够影响Bcl-6的转录活性。我们使用了能够被Bcl-6直接结合而不被TCF-1调控的突变Bcl6启动子区域进行报告基因检测，当P33与Bcl-6同时存在的情况下，导入该启动子区域的CD4+T细胞表达更高的Thy1.1。
　　最后，我们在SMARTA细胞中共转质粒，在沉默Tcf7的同时过表达Bcl6，沉默Tcf7造成的TFH细胞缺陷能够完全被过表达Bcl6挽救。进一步证实TCF-1是Bcl-6-Blimp1轴上游转录调控因子。
　　结论：
　　结合表型研究中的发现以及我们在机制研究中的重要结果。我们证实TCF-1是影响TFH细胞分化及功能的重要转录因子。在TFH细胞分化早期，TCF-1通过直接的转录调控，作用于Bcl-6-Blimp1轴，促进Bcl-6并抑制Blimp1表达，推动细胞向TFH细胞方向分化;在成熟的TFH细胞中，TCF-1 P33亚型能够与Bcl-6直接相互作用，影响Bcl-6的转录功能，从而影响TFH细胞辅助B细胞的功能。TCF-1从多种角度发挥作用，调节TFH细胞的分化及功能。

目录

声明

英文缩写一览表

摘要

第一章 前言

第二章 筛选TCF-1调控TFH细胞分化的靶基因

2．1 实验材料和方法

2．2 实验结果

2．3 小结

2．4 讨论

第三章 TCF-1直接调控Bcl-6-Blimp1轴影响TFH细胞分化

3．1 实验材料和方法

3．2 实验结果

3．3 小结

3．4 讨论

第四章 TCF-1与Bcl-6相互作用影响TFH细胞功能

4．1 实验材料和方法

4．2 实验结果

4．3 小结

4．4 讨论

全文结论

参考文献

文献综述一 滤泡辅助T细胞转录调控研究进展

文献综述二 转录因子TCF-T调控成熟T细胞功能的研究进

在读期间发表论文

致谢