FGL2在T细胞免疫应答中以及TCF-1和LEF-1协同调控TFH细胞功能的机制研究

摘要

研究背景与目的：
　　滤泡辅助T细胞(follicular helper T cells，TFH)是CD4+辅助T细胞的一个特殊亚群，它在生发中心反应(germinar center，GC)的建立，GC B细胞通过高亲和力抗原受体的选择，选择性分化为记忆B细胞和长寿命浆细胞的过程中起到了关键的作用。TFH细胞分化是一个多阶段、多因子参与的过程[1]，包含了Bcl6和其他一些转录因子，其中Bcl6在TFH细胞分化过程中起到了决定性的作用[2]。此外TCF-1、IRF4、Batf、 Ascl2和STATs都参与到了TFH细胞的分化调控[1]。
　　FGL2，纤维蛋白原样2凝血酶原酶，又称纤维介素(Fibroleukin)。分为膜相关蛋白(mFGL2)和分泌蛋白(sFGL2)两型。mFGL2能够将凝血素转变为凝血酶。sFGL2可抑制HBV病人CD8+T细胞的增生和功能[3]。同时，它还维持了TReg细胞的活性，体外实验中抑制了T细胞增生[4]。然而FGL2在体内对于T细胞免疫应答的影响还未见报道。
　　T细胞因子1(TCF-1，Tcf7基因编码)和淋巴增强结合因子1(LEF-1，Lef1基因编码)是经典Wnt通路的下游效应转录因子，在胸腺细胞发育、T细胞分化和记忆CD8+T的维持上起到重要作用[5，6]。LEF-1和TCF-1在CD4+CD8+双阳阶段，决定了胸腺细胞向CD4+T或者CD8+T方向分化[7，8]。在成熟的CD8+T细胞，TCF-1在记忆CD8+T细胞的维持中发挥了重要的作用，并协同LEF-1调控了记忆前体细胞的形成和记忆CD8+T细胞的再次应答能力[9-11]。在成熟的CD4+T细胞，TCF-1通过上调GATA-3的表达促进了TH2细胞的分化[12]。TCF-1的表达在发育的胸腺细胞和活化的CD4+T细胞中限制了IL-17A的表达[13]。在淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)急性感染模型中，TCF-1通过调控Bcl6-Blimp1轴启动了TFH细胞的分化[15]。然而，TCF-1和LEF-1在蛋白免疫过程中对于TFH细胞的分化和功能的影响也未见报道。
　　因此，本课题重点研究在小鼠体内实验中FGL2对T细胞免疫应答的影响以及在蛋白免疫过程中TCF-1和LEF-1对TFH细胞分化和功能的作用。
　　本研究的主要内容:
　　1.FGL2在急性病毒感染过程中对T细胞免疫应答的影响
　　我们首先检测了LCMV感染后，血浆中FGL2的变化情况。结果显示LCMVArmstrong急性感染后第3、5和8天，小鼠血浆中的FGL2浓度分别上调了65％、111％、151％。为了验证FGL2的上调是否对T细胞的免疫应答产生影响，我们用LCMV感染Fgl2基因敲除小鼠和C57BL/6J小鼠，第8天检测T细胞的增殖、分化和功能。我们还过继转移SMARTA小鼠细胞（具有特异性识别LCMV GP66-77表位的TCR的CD4+T细胞）和P14小鼠细胞（具有特异性识别LCMV GP33-41表位的TCR的CD8+T细胞）到Fgl2基因敲除小鼠和C57BL/6J小鼠体内，检测了FGL2作为外源性影响因素对T细胞增殖、分化和功能的影响。结果显示:实验组和对照组TFH细胞、TH1细胞和效应CD8+T细胞的频率和数量均无明显差异(p＞0.05）。结论提示了在体内实验中，虽然FGL2在急性病毒感染模型中表达上调，但FGL2不影响T细胞的免疫应答。
　　2.TCF-1和LEF-1在蛋白免疫过程中协同调控TFH细胞的功能
　　我们用NP-CGG或融合LCMV GP66-77表位的GST蛋白(GST-GP66-77)与弗氏佐剂混合，分别免疫已经被Tamoxifen诱导敲除的Lef1fl/+Tcf7fl/+(Ctrl)、Lef1-/-Tcf7-/-(DKO)、Lef1-/-Tcf7fl/+(LKO)和Lef1fl/+Tcf7-/-(TKO)小鼠。免疫后第8天，检测小鼠腹股沟淋巴结中TFH细胞的频率和GC B细胞的频率。结果显示:在NP-CGG蛋白免疫条件下，和Ctrl组相比，DKO、LKO和TKO组的TFH细胞的频率均无明显变化(p＞0.05）。TKO组的GC B细胞的频率下降了约40％，DKO组下降了约80％(p＜0.001)。
　　我们认为，GC B细胞频率的降低可能有两种原因:1、B细胞中的TCF-1和LEF-1同时也被Tamoxifen诱导敲除了，从而导致GC B细胞频率的降低;2、TCF-1和LEF-1在蛋白免疫过程中协同调控了TFH细胞的功能，从而影响了GC B细胞的分化。下一步，我们将利用过继转移SMARTA细胞或B1-8Hi细胞（特异性识别NP表位的B细胞）以及体外共培养实验来研究GC B细胞频率下降的原因并探求TCF-1和LEF-1在其中发挥功能的分子机制。
　　总结:
　　我们证实了在LCMV感染后，血浆中FGL2的表达上调，但这种上调在体内实验中不影响T细胞的免疫应答。在NP-CGG蛋白免疫模型中，和Ctrl组相比，DKO、LKO和TKO组的TFH细胞的频率均无明显变化，而TKO组的GC B细胞的频率下降了约40％，DKO组下降了约80％。这种降低是因为TCF-1和LEF-1协同调控了TFH细胞的功能，还是B细胞的分化，以及TCF-1和LEF-1在其中发挥功能的分子机制还有待进一步研究。

目录

声明

英文缩写一览表

摘要

第一章 前言

第二章 FGL2在急性病毒感染过程中对T细胞免疫应答的影响研究

2．1 实验材料和方法

2．2 实验结果

2．3 小结

2．4 讨论

第三章 TCF-1和LEF-1在蛋白免疫过程中协同调控TFH细胞的功能

3．1 实验材料和方法

3．2 实验结果

3．3 小结

3．4 讨论

全文结论

参考文献

文献综述 转录因子调控TFH细胞分化的研究进展

攻读硕士期间发表论文

致谢