低氧条件下BNIP3对表皮细胞迁移的影响及其机制研究

摘要

创面愈合是在多种组织和细胞协同作用下共同完成的精密调控的过程。再上皮化是创面愈合进程中早期启动的生物学事件，在重建皮肤机械屏障的完整性中发挥重要作用，而表皮细胞迁移是贯穿于这一过程的关键步骤，已成为创面愈合研究的焦点。但低氧微环境对创面愈合过程中皮肤表皮细胞迁移是否具有调控作用及其分子调控机制，迄今均未完全阐明。
　　BNIP3（Bcl-2 nineteen-kilodalton interacting protein3）是仅含有非典型BH3结构域的Bcl-2蛋白质家族的成员之一，是一种低氧反应蛋白。大量文献证实BNIP3参与细胞增殖、凋亡、自噬、分化等生物学行为的调节，并且在肿瘤的发生发展，心肌肥大与萎缩，脑缺血缺氧损害等多种疾病过程中发挥重要作用。BNIP3分布在人表皮细胞中，并参与调控其分化并维持其自稳态。但BNIP3对表皮细胞迁移是否具有调控作用，目前尚无相关文献报道。
　　创面形成后，多种信号通路激活并动员创面修复细胞，加速创面再上皮化进程。黏着斑激酶(FAK)是分布于细胞质中的一种酪氨酸蛋白激酶，在整合素家族调控细胞运动中发挥核心作用，主要通过397号位点的酪氨酸自磷酸化而激活。大量文献资料表明FAK参与创面愈合过程中表皮细胞迁移的调控。特异性的整合素单克隆抗体的应用可下调FAK的活化水平并抑制表皮细胞迁移;FAK缺失的小鼠创面愈合明显延迟，这与FAK的活化受阻密切相关。在多种肿瘤中，FAK信号转到途径及其下游信号参与调节肌动蛋白细胞骨架的聚合、解聚及重排等细胞迁移相关的关键环节，而BNIP3可以调节细胞肌动蛋白骨架的重构。因此我们推测，FAK可能参与了BNIP3对表皮细胞迁移的调控。
　　在多种哺乳动物细胞的研究中发现BNIP3可通过其BH3结构域竞争Bcl-2与Beclin-1的结合位点破坏Bcl-2/Beclin-1的稳定结合，从而启动自噬(Autophagy)。自噬是真核细胞中高度保守的一种溶酶体降解途径，在维持机体的稳态中发挥重要作用。功能学上，自噬参与调控多种生理及病理过程，如生长发育、炎症反应、肿瘤的发生与侵袭转移等。近年来，表皮细胞自噬的生物学意义也受到了广泛关注。某些具有生物活性的物质或理化因素可诱导表皮细胞自噬;自噬参与调控表皮细胞分化;自噬可减少紫外线照射引起的表皮细胞损伤，促进其存活。然而，自噬对表皮细胞迁移的影响尚缺乏研究证据。
　　目的：
　　本研究提出低氧条件下BNIP3通过调节FAK或自噬进而调控创面愈合过程中表皮细胞迁移的假设，通过检测低氧条件下BNIP3对表皮细胞迁移的影响，并探讨其对表皮细胞FAK及自噬的调节，从而明确BNIP3调节表皮细胞迁移的作用机制。
　　方法：
　　1.建立体外低氧培养的小鼠原代表皮细胞模型，模拟创面低氧微环境，观察低氧(2％O2:3h、6h、9h)处理前后表皮细胞运动性和迁移及BNIP3蛋白表达的变化规律;
　　2.通过siRNA转染技术构建BNIP3下调的小鼠原代表皮细胞模型并进行低氧处理(2％O2:6h)，WB检测siRNA转染的有效性;在活细胞工作站下观察BNIP3下调对表皮细胞运动性的影响;体外片层细胞划痕实验模拟创面愈合过程，观察BNIP3下调对表皮细胞迁移的影响，从而明确低氧条件下BNIP3对表皮细胞迁移的调控作用;
　　3.通过WB检测低氧(2％O2:3h、6h、9h)处理前后表皮细胞中p-FAK表达及自噬的变化;并检测低氧条件下BNIP3下调对表皮细胞FAK及自噬的影响;通过TAE226选择性抑制FAK的活化检测低氧条件下FAK对表皮细胞运动性及迁移的调控;最后，在常氧条件下用雷帕霉素激活自噬，检测自噬对表皮细胞运动性及迁移的影响，从而初步明确低氧条件下BNIP3调控表皮细胞迁移的可能作用机理。
　　结果：
　　1.低氧促进小鼠原代表皮细胞的运动性及迁移，并显著上调BNIP3的表达，且随低氧处理时间延长呈上升趋势，这与表皮细胞运动性随低氧处理时间变化的规律基本契合;
　　2.应用靶向BNIP3的siRNA序列下调BNIP3，通过单个细胞运动性检测（活细胞工作站观察）及体外细胞划痕实验，我们发现BNIP3的下调可有效地逆转低氧对表皮细胞运动性及迁移的促进作用，说明BNIP3参与调控低氧促进的表皮细胞迁移;
　　3.低氧处理促进FAK的活化，并使自噬标志物LC3-Ⅱ、p62显著上调;低氧条件下用siRNA转染下调BNIP3可显著抑制FAK信号通路的激活，并且抑制FAK的活性可逆转低氧表皮细胞迁移的促进作用，说明FAK信号通路参与了低氧条件下BNIP3介导的表皮细胞迁移;低氧条件下下调BNIP3可显著抑制LC3-Ⅱ的上调，说明低氧条件下BNIP3对表皮细胞自噬具有调控作用;但尽管常氧条件下雷帕霉素可显著抑制表皮细胞迁移，雷帕霉素模拟的自噬与低氧处理诱导的自噬不尽相同，要明确BNIP3是否通过自噬调节表皮细胞迁移尚需要进一步研究。
　　结论：
　　低氧上调表皮细胞中BNIP3的表达，并促进FAK信号通路的的活化，从而促进表皮细胞迁移;同时低氧可激活自噬，但自噬是否参与低氧条件下BNIP3对表皮细胞迁移的调控尚需进一步研究。
　　本研究首次明确BNIP3在创面再上皮化中的作用，并初步阐明其作用机制，为进一步明确创面愈合规律提供新视角，并为临床创面治疗提供了新的可能靶点。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 低氧对表皮细胞迁移及BNIP3表达影响的研究

2．1 材料与实验方法

2．2 实验结果

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 低氧条件下BNIP3对表皮细胞迁移调控作用的研究

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 低氧条件下BNIP3调控表皮细胞迁移的机制研究

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

4．4 小结

全文结论

参考文献

文献综述 低氧对表皮细胞迁移的影响及其作用机制

攻读硕士期间发表和投稿的论文

致谢