超高效液相色谱/超临界流体色谱-串联质谱联用技术同时测定婴幼儿配方乳粉中多种维生素的研究

摘要

婴幼儿成长过程中对维生素的需求仅靠母乳是很难得到满足的，因此在婴幼儿配方奶粉中添加各种维生素营养强化剂是十分必要的，要保证婴幼儿配方奶粉的质量，必须严格监控维生素的含量是否满足要求。依据维生素的性质主要可分为水溶性维生素（如C、B族）和脂溶性维生素（如维生素A、D、E、K）等二十多种。目前奶粉中添加维生素含量的检测方法主要有微生物法、光谱法、色谱法等。同时由于需检测的维生素种类繁多，样品前处理和检测方法上又无法相互兼容，因此整个检测过程费时、费力，而且不能满足同时快速检测的要求。
　　本文基于维生素的物理化学性质，分别建立了14种水溶性维生素和4种脂溶性维生素同时检测的超高效液相色谱-串联质谱方法（Ultra-performance liquid chromatography tendem mass spectrometry，UPLC-MS/MS），以及5种脂溶性维生素同时检测的超临界流体色谱-质谱联用法（Supercritical fluid chromatography tendem mass spectrometry，SFC-MS/MS），不仅可以大大缩短分析时间、减少工作量、提高了效率，还减少了有机试剂的使用；分别利用标准质控奶粉对方法的适用性进行了考察，结果表明，方法灵敏准确，可为婴幼儿配方奶粉中多种维生素的同时检测提供技术支持。主要研究内容与研究结果如下：
　　1、采用UPLC-MS/MS法建立了同时测定婴幼儿配方奶粉中的14种水溶性维生素的分析方法。分别对配方奶粉的样品前处理条件、色谱分离和质谱分析条件进行了优化，利用三重四级杆质谱的多反应监测（Multi-reaction monitor，MRM）检测模式下和内标法定量。结果表明，利用三氯甲烷进行简单有效的蛋白沉淀后，单个样品仪器分析时间仅为6min，14种维生素的呈现良好线性相关性（R2>0.9961），检测限分别为维生素C3.0μg/L，牛磺酸15μg/L，其他目标物≤0.3μg/L，两种质控奶粉的含量测定结果均能在限制范围内，日内精密度0.60％～8.78%，日间精密度0.80%～23.29%，测定结果与国标方法相比偏差<15%。将本方法应用于市售奶粉样品，检测结果合格。
　　2、利用UPLC-MS/MS建立了一种快速、灵敏的能同时测定婴幼儿配方奶粉中脂溶性维生素A、D2、D3、α-生育酚的分析方法。利用MRM模式检测和内标法定量。对色谱、质谱检测条件和样品皂化过程的条件进行了优化。结果表明：维生素A、D2、D3、α-生育酚在20～200μg/L范围内呈良好线性关系（R2>0.9960），回收率分别为97.54%、107.5%、88.06%和101.0%；检测限分别为0.6、3.0、0.4和0.06μg/L；日内和日间精密度均小于10%。本方法简便有效，检测结果准确灵敏，可用于婴幼儿配方奶粉中上述脂溶性维生素含量的同时测定。
　　3、采用SFC-MS/MS法，结合皂化法进行样品前处理，建立了同时检测脂溶性维生素D2、D3、E、K1、K2的分析方法。维生素D2、D3、E、K1、K2分别在0.1～1.0、0.05～0.5、0.5～5.0、0.5～5.0、0.5～5.0mg/L内线性关系良好(R2≥0.9975)，经内标校正操作损失和质谱基质效应后，回收率分别从89.61%、95.57%、104.0%、78.77%、70.05%提高到100.9%、98.67%、106.4%、105.8%和96.85%，日内精密度≤8.71%，日间精密度≤12.54%，检测限分别为25、30、15、1.5、6.0μg/L，可满足配方奶粉中脂溶性维生素含量的测定的要求。
　　4、利用SFC/MS/MS技术，建立了检测婴幼儿配方奶粉中的维生素K1、K2的含量的分析方法。用酶解法进行样品前处理，依次优化了酶种类、酶解时间、温度等条件，解决了皂化法中维生素K碱不耐受的问题，使用外标法定量，维生素K1、K2的回收率为108.6%和97.65%，日内和日间精密度分别小于13.02%和10.57%，可满足配方奶粉中脂溶性维生素含量的测定的要求。该方法不需使用同位素内标校正，简化了步骤，可满足配方奶粉中维生素K1、K2的测定要求。
　　5、针对以上方法建立过程出现的一些明显的质谱现象及其机理进行了探讨，质谱的响应的影响因素有溶剂pH、溶剂离子强度、其他物质的离子化竞争、样品基质效应、离子源种类等，其中烟酰胺的峰形会随着溶剂的pH的降低有明显分裂和前延；维生素B1的响应会随着pH的降低或离子强度的增加而增加；脂溶性维生素A、D、E、K在使用UPLC-MS/MS法和SFC-MS/MS法分析时，ESI源和APCI源呈现出不同优势。这些研究为提高色谱-质谱联用维生素测定方法的准确性和灵敏度提供了理论基础。

目录

声明

第一章 绪论

1.1 概述

1.2 婴幼儿配方奶粉中的维生素

1.3 奶粉中维生素测定的前处理方法研究进展

1.4 配方奶粉中水溶性维生素测定方法的研究进展

1.5 配方奶粉中脂溶性维生素测定方法的研究进展。

1.6 婴幼儿配方奶粉维生素分析中的难点

1.7 本课题的主要研究内容与意义

参考文献

第二章 UPLC-MS/MS法测定配方奶粉中的水溶性维生素

2.1 前言

2.2 实验部分

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

参考文献

第三章 UPLC-MS/MS法测定配方奶粉中的脂溶性维生素

3.1 前言

3.2 实验部分

3.3 结果与讨论

3.4本章小结

参考文献

第四章 SFC-MS/MS法测定配方奶粉中的脂溶性维生素

4.1 前言

4.2 实验内容

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

参考文献

第五章 维生素质谱离子化与响应的机理探讨

5.1 前言

5.2 实验部分

5.3 结果与讨论

5.4 本章小结

参考文献

附录 攻读学位期间发表的论文

致谢