Nanog-非肝癌干细胞维持Nanog+肝癌干细胞自我更新作用的分子机制研究

摘要

肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，而在中国肝癌的发病率超过全球总发病率的50％，居我国恶性肿瘤死亡原因第二位。近年来，虽然以手术为主辅以其他治疗手段的个体化综合治疗理念对攻克肝癌有了长足的进步，但仍难改善其预后差和5年生存率低的现状。在肿瘤干细胞理论学说前提下，诸多研究表明肿瘤干细胞是肿瘤始动、生长扩张、复发及侵袭转移的根源。肝癌干细胞的存在亦是导致肝癌治疗失败的关键之一，因此深入研究肝癌干细胞“干性”维持的分子机制及与其所在微环境的动态平衡关系，已成为肿瘤学研究的一个重要方向。
　　肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells CSCs)因其独特的生物学特性及在肿瘤中的主导作用已越来越受到重视，而随着对肿瘤干细胞的深入专研，学者们发现肿瘤干细胞之所以能够良好地发挥其“干性”的生物学作用，与其所在的肿瘤微环境生态体系密不可分。既往研究报道人胚胎干细胞干性的获得与维持，不仅受其基因的内在调控也受到由其分化而来的成纤维样细胞分泌的支持生长因子的外源性调控。考虑到肿瘤干细胞与胚胎干细胞的诸多共性及相似的干性维持网络，分化型肿瘤细胞作为肿瘤干细胞微环境中的组成部分，对维持肿瘤干细胞自我更新的作用是肿瘤学研究的新方向。而肝癌中，探讨肿瘤细胞亚群之间以及肝癌干细胞与非肝癌干细胞间的相互作用关系正是该课题的研究任务所在。
　　本研究在前期建立的以Nanog为标记的肝癌干细胞模型基础上，新近发现非肿瘤干细胞与肿瘤干细胞群体间存在着相互促增殖和促瘤作用，并且这种作用可能通过炎症因子白介素IL-17E（Interleukin-17E IL-17E）的介导而实现。研究证明炎症因子作为肿瘤微环境中的重要组成部分，为肿瘤发生发展提供更适合的土壤条件，作用不可小觑。而促炎因子IL-17家族作为新近被发现的关键信号分子，对维持肿瘤干细胞“干性”以及在肿瘤演进过程中均发挥重要的促进作用。但对于IL-17E与肿瘤发生发展的关系有待深入研究，尤其在肝癌中的生物学作用以及与肝癌干细胞的关系知之甚少。
　　目的：
　　该课题对研究中发现的以Nanog-非肝癌干细胞对Nanog+肝癌干细胞具有自我更新维持作用的新现象及其分子机制进行了探讨。
　　方法:
　　1.干细胞的分离及鉴定:体内、体外实验验证由流式分选获得高表达绿色荧光蛋白的Nanog+肝癌细胞具有肿瘤干细胞特性。利用该模型通过荧光蛋白的表达水平，可以动态监测细胞的干性状态。
　　2.体外细胞培养以及动物模型构建:主要设置单纯Nanog+肝癌干细胞组、单纯Nanog-非肝癌干细胞组和按照不同比例混合两群细胞组，通过直接混合和间接用细胞上清液及Millicell混合培养方式，观察两群细胞间相互作用关系。NOD-SCID裸鼠不同数量级肝癌细胞体内成瘤实验验证体外结果。
　　3.蛋白芯片技术:流式分选出Huh7肝癌细胞系中Nanog-非肝癌干细胞和Nanog+肝癌干细胞，分别培养24小时后收集两群细胞上清液，蛋白芯片技术检测两群细胞中细胞因子差异性表达情况。并用免疫荧光、免疫组化、ELISA、RT-CPR和Western Blot在两株以上肝癌细胞系内检测验证蛋白芯片结果。
　　4.慢病毒载体构建及包装:用于构建本课题涉及的转基因293T细胞系和已有的带红色荧光蛋白RFP-635慢病毒载体骨架。构建下调IL-17RB和IL-17E的慢病毒载体Lv-shIL-17RB、Lv-shIL-17E以及对照Lv-shscrambled，通过磷酸钙沉淀法转染包装细胞系293T,包装含目的序列的假慢病毒颗粒，筛选稳定转染Huh7、PLC/PRF/5肝癌细胞系。
　　5.生物学功能验证:CCK8实验检测外源性给予因子IL-17E、IL-17E抗体以及干扰受体RB表达后细胞增殖活性;以及体外成球克隆实验和体内NOD-SCID小鼠成瘤实验检测IL-17E/RB在干性维持中的作用。
　　6.信号通路调控关系的分析:通过RT-PCR，Western Blot，等方法检测IL-17E因子、干扰IL-17RB处理后的相关下游信号通路的表达情况。以及信号通路激活剂和抑制剂的动态调控分析。
　　7.生物信息工程技术和统计学分析:计算机模拟IL-17Rs蛋白质结构分析IL-17E/RB激活下游信号通路机制;收集不同级别、临床随访信息完整的肝癌（原发瘤和复发瘤）标本，检测肝癌临床组织标本中IL-17RB、Nanog的表达情况:免疫组织化学染色和统计分析。
　　结果:
　　1.将分选所得Nanog-非肝癌干细胞和Nanog+肝癌干细胞分别单独培养和按照不同比例混合培养，发现混合培养组细胞增殖能力均较强于单独Nanog-非肝癌干细胞组或Nanog+肝癌干细胞组，尤其是加入少量非肝癌干细胞至肝癌干细胞中（如1∶9的比例）可明显增强群体细胞的增殖能力。并且这种促增殖能力可以通过细胞的培养上清液培养方式或者Millicells分隔混合培养的细胞间接作用而实现。
　　2.NOD-SCID小鼠成瘤实验，验证了Nanog+肝癌干细胞组成瘤能力强于Nanog-非肝癌干细胞组;混合细胞组成瘤能力强于单纯Nanog+细胞组或Nanog-细胞组;最早成瘤时间及最大成瘤体积均发生在Nanog(-/+=1∶9)混合细胞组，肿瘤生长曲线左移。
　　3.蛋白芯片结果显示:Nanog-非肝癌干细胞上清液高表达TGF-β2、IL-17E和MMP-13;Nanog+肝癌干细胞上清液高表达IGFBP-7、GDF-15、WIF-1、uPAR、VEGFR2、CXCL16、和TSP。RT-PCR进一步验证蛋白芯片结果，发现Nanog-非肝癌干细胞稳定高表达IL-17E，免疫荧光、免疫组化以及Western Blot检测发现Nanog+肝癌干细胞细胞膜和胞浆高表达IL-17E受体RB。
　　4.给予外源性IL-17E处理后，可明显促进肿瘤干细胞增殖能力以及克隆形成和成球能力;而干扰受体IL-17RB的表达，可明显抑制肿瘤干细胞增殖能力以及克隆形成和成球能力。
　　5.外源性IL-17E处理和干扰受体IL-17RB后，检测到相关信号通路NF-κB和Stat3磷酸化蛋白水平表达改变。IL-17E与信号通路的激活剂作用相似，而干扰IL-17RB与信号通路的抑制剂作用相似。
　　6.利用生物信息工程技术模拟分析IL-17RB蛋白质结构，发现受体RB的SEFIR区域中含有能够直接与Stat3上游分子JAK相结合的BOX1、BOX2结构域，提示IL-17E/RB信号轴可能通过与Jak的直接结合而非依赖于IL-6途径激活Stat3信号转导。
　　7.临床肝癌组织标本中IL-17RB和Nanog的表达显著高于癌旁组织，并且两者表达成正相关，进一步验证了体外细胞系的实验结果。
　　结论:
　　本研究利用Nanog肝癌干细胞模型，研究和探讨肝癌细胞亚群间的相互关系，揭示非肝癌干细胞具有维持肝癌干细胞自我更新的支持作用。并通过蛋白芯片检测发现炎症因子白介素17E在Nanog阴性细胞中高表达;继而又证实其受体IL-17RB在Nanog阳性细胞中高表达。这种母代肿瘤干细胞与子代非肿瘤干细胞间相互差异性表达受体与配体的现象提示IL-17E/17RB有可能是Nanog-非肝癌干细胞维持Nanog+肝癌干细胞“干性”的重要调控分子。而这种调控作用可以通过激活下游信号通路NF-κB和Stat3的信号转导来实现。该研究以分化型肿瘤细胞作为肿瘤干细胞微环境的组成部分为切入点，为解密肿瘤干细胞“干性”维持网络机制提供新思路。对炎症因子IL-17E在肿瘤以及在维持肿瘤干细胞自我更新能力中的作用，做出了新的探索，并对其激活下游信号通路Stat3的直接途径指明了研究方向，为进一步靶向肝癌干细胞治疗肝癌提供理论基础，受体RB在肝癌组织中的高表达，为深入探讨其在肝癌临床研究中具体生物学功能提供新的思路。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 Nanog+肝癌干细胞与Nanog-非肝癌干细胞间的相互作用

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．6 小结

第三章 Nanog+肝癌干细胞与Nanog-非肝癌干细胞间的相互促增殖和促瘤作用的调控分子

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 IL-17E／RB信号轴参与非肝癌干细胞对肝癌干细胞自我更新支持作用的机制探讨

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．3 结果

4．4 讨论

4．5 小结

全文总结

参考文献

文献综述 肿瘤干细胞巢维持肿瘤干细胞干性特征的重要性

攻读学位期间科研成果

致谢