ALA-PDT对铜绿假单胞菌生物膜及其QS系统的影响的实验研究

摘要

目的：
　　氨基酮戊酸-光动力疗法(δ-Aminolevulinic acid photodynamic therapy，ALA-PDT)被认为是一种非常有前景的新的消除微生物感染的治疗方法。PDT因它良好的疗效目前已经被广泛用于某些感染性皮肤病的治疗，如痤疮、病毒疣等。此外，一些研究发现PDT对于细菌真菌及其生物膜(Biofilm，BF)的感染同样有效，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌及一些耐药菌（如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）等。然而，很少有PDT对生物膜结构、功能以及其中作用的机制的研究。群体感应(quorum sensing，QS)系统是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)生物膜形成和产生毒力因子的最重要的调节系统，而PDT对铜绿假单胞菌生物膜相关研究中对QS系统及相关基因的影响从未被报道过。本研究通过建立铜绿假单胞菌体外生物膜模型，探索ALA-PDT对铜绿假单胞菌杀灭作用及对其生物膜清除作用及机制。为我们临床应用ALA-PDT治疗铜绿假单胞菌相关感染提供实验依据。
　　方法:
　　1.建立铜绿假单胞菌体外生物膜模型，不同浓度的ALA、单纯照光、ALA-PDT分别根据分组要求进行相应的处理;
　　2.用激光共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscopy，CLSM)检测ALA在铜绿假单胞菌体内的转化;
　　3.用XTT活菌定量实验检测ALA-PDT对铜绿假单胞菌生物膜中细菌的杀灭作用;
　　4.通过对铜绿假单胞菌生物膜的荧光染色，使用CLSM观察ALA-PDT对生物膜中活菌的杀灭作用及对生物膜三维结构的影响;
　　5.使用扫描电镜(Scanning electron microscopy，SEM)观察ALA-PDT对铜绿假单胞菌生物膜中细菌及生物膜结构和功能的影响;
　　6.毒力因子检测试验研究ALA-PDT对绿脓菌素和弹性蛋白酶分泌的影响;
　　7.通过实时定量PCR(qRT-PCR)检测基因的表达，研究ALA-PDT对毒力因子调控基因(phzH、LasB)与QS相关基因(lasI、lasR、rhlI、rhlR)表达的影响。
　　结果:
　　1.ALA孵育组在CLSM下可见大量砖红色荧光，而对照组在CLSM下未见无明显荧光;
　　2.XTT活菌定量实验提示，ALA-PDT能有效杀灭铜绿假单胞菌生物膜中的活细菌，这种杀灭作用与ALA的浓度呈正相关，单纯ALA孵育、单纯照光组与对照组无明显差异，不能产生光动力效应;
　　3.从CLSM和SEM的观察结果看出，ALA-PDT对铜绿假单胞菌生物膜的清除作用与ALA的浓度呈正相关，且ALA-PDT能明显杀灭生物膜中的活细菌，同时破坏生物膜的三维结构，单纯ALA孵育、单纯照光组与对照组无明显差异，不能产生光动力效应;
　　4.从毒力因子检测试验看出，ALA-PDT能显著抑制铜绿假单胞菌毒力因子的分泌，这种抑制作用与ALA的浓度呈正相关，单纯ALA孵育、单纯照光组与对照组无明显差异，不能对毒力因子的分泌产生抑制效应;
　　5.从qRT-PCR试验结果看出，单纯ALA孵育和红光照射时，铜绿假单胞菌毒力因子调控基因和QS相关调控基因的表达无明显变化，只有ALA和红光照射同时存在的情况下，才能发挥PDT作用，ALA-PDT能明显降低QS系统相关基因的表达，这种对基因表达调控的抑制效应与ALA的浓度呈正比。
　　结论:
　　我们的研究初步阐明了ALA-PDT清除铜绿假单胞菌生物膜的作用及其相关机制。ALA-PDT产生的单线态氧能够产生毒性效应破坏靶细菌的细胞膜、细胞器、细胞核，同时破坏了QS系统的基因和蛋白，这种对QS系统的作用进一步破坏了生物膜，同时减少了生物膜的复发率。我们的研究结果表明，ALA-PDT可以有效的杀灭体外的铜绿假单胞菌及其生物膜，为我们在临床中使用PDT治疗铜绿假单胞菌相关感染提供了进一步的实验依据。PDT是目前对于耐药性或难治性细菌感染的最有前景的治疗方法之一，需要我们更加深入的进行研究。

目录

声明

缩略词表

摘要

第一章 前言

1．1 来自临床工作和临床课题的启发

1．2 选题背景

1．3 研究意义

1．4 研究主要内容

第二章 ALA-PDT对铜绿假单胞菌生物膜抑制效应的研究

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

第三章 ALA-PDT对铜绿假单胞菌分泌毒力因子及QS系统的影响的初步研究

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述 光动力学疗法在感染性疾病的临床应用

攻读学位期间发表的论文

致谢