VPAC1受体放射性配体99mTc-TP1724的制备、性质鉴定及其动物体内研究

摘要

研究的背景及目的：G蛋白偶联受体中有一种被称为血管活性肠肽受体（VIPR），目前发现有VPAC1、VPAC2和PAC1三种亚型。研究证实，VPAC1在结直肠癌、乳腺癌、肺癌等多种肿瘤原发及其转移灶细胞中高水平表达，而 VPAC2仅表达于良性平滑肌瘤等少数肿瘤；VPAC1高亲和力结合位点（Bmax）是正常组织的22.5～57.9倍。因此，VPAC1是一较为理想的肿瘤分子影像与靶向治疗研究靶标，并显示出潜在的应用前景。然而，目前VIP受体显像研究探针均为VIP全分子或其类似物，皆能与上述三种受体亚型结合，故缺乏针对VPAC1的高特异性。
　　课题组前期利用噬菌体展示肽库全细胞差减筛选技术，筛选并鉴定得到高特异靶向VPAC1的线性十二肽（GFRFGALHEYNS，简称VP2），其与VPAC1的结合亲和力显著高于天然配体VIP。本研究拟通过多肽化学合成技术合成VP2，同时在其氨基末端偶联甘氨酸-丙氨酸(D)-甘氨酸-甘氨酸-氨基丁酸［G(D)AGG-Aba］作为双功能螯合剂，探讨99mTc标记G(D)AGG-Aba-VP2（TP1724）的最佳条件，鉴定99mTc-TP1724的理化性质，研究其示踪动力学特性、正常动物体内的生物分布和动态显像变化特点，奠定以受体VPAC1为靶点肿瘤显像的基础。
　　研究方法：
　　1．99mTc-TP1724制备：化学方法合成并制备多肽 TP1724，99mTc的标记（SnCl2作为还原剂），测定标记率（纸层析法），比活度计算（直接法）。
　　2．99mTc-TP1724多肽理化性质的鉴定：通过稳定性实验（体外）、一步法标记冻干试剂盒实验、HPLC（高效液相色谱）分析、HSA(人血清蛋白)结合实验、Cys(半胱氨酸)置换实验和脂(油)/水分配实验。
　　3．示踪动力学的实验：选取健康的家兔9只，俯卧固定于木质实验台上，每只经左侧耳缘静脉注射99mTc-TP1724200μl（37 MBq）；分别在注射1.5min、5min、10min、30min、60min、120min及240min后从右侧耳缘静脉抽取血液并称重、测量放射性（cpm）。按血液密度1 g/ml计，经参考源校正，将血样品放射性换算成kBq/L。用药代动力学（DAS3.1.6版本）软件分析，智能化分析平均血液放射性的浓度-时间数据，判断99mTc-TP1724在健康家兔体内的最佳房室模型，并得到其药-时关系式及示踪动力学参数。
　　4．正常大耳兔体内SPECT显像：Siemens Symbia T6 SPECT/CT，探头配备常规准直器（低能高分辨率准直器），能峰为140 KeV，窗宽为20％，矩阵128×128，Zoom（放大系数）＝1.0。将家兔绑定在实验木板上（仰卧位），胸腹部对准探头视野中点。注射99mTc-TP172474MBq（经左侧耳缘静脉)，然后以1帧/sec采集60 sec、1帧/min采集59min；分别于90、120、150、180和240 min经时间衰减校正各预置计时采集1帧。利用ROI技术，作出注射99mTc-TP1724后1h内动态影像的心、肾、肝、膀胱等组织器官T-A曲线。
　　5．生物分布研究（正常昆明小鼠体内）：35只小鼠分成7组（随机表法），5只/组。每只注入99mTc-TP1724100ul（3.7 MBq），经尾静脉注射入体内，分别在以下7个时间点（1.5min时、5min时、10min时、0.5h时、1h时、2h时与4h时）将小鼠立即处死，收集其血、心脏、肾脏、肝脏、肠、肺脏、肌肉（大腿）、大脑和骨（大腿）等组织器官称重，然后测定其cpm。经参考源校正后，换算为%ID/g。
　　6．大耳兔炎症模型显像：取正常大耳兔3只，分别于右后肢内侧注射松节油500μl，常规饲养7天后形成局部无菌性炎症。Siemens Symbia T6 SPECT/CT，矩阵256×256，余参数同4。家兔绑定于实验木板上（仰卧位），胸腹部对准探头视野中点。99mTc-TP1724经左耳缘静脉注射74MBq，并于0.5、2和5h分别预置计时600s、636s、714s、801s、898s、990s采集静态图像1帧。利用ROI技术计算各时相点炎症灶及其对侧正常软组织放射性的T/NT比值。
　　结果：
　　1．99mTc-TP1724制备：化学方法合成TP1724的纯度为97.80%；99mTc-TP1724的标记率为(96.57±0.71)%，其比活度(直接法)为(25.52±0.29)TBq/mmol。
　　2．理化性质鉴定：在室温下，标记的溶液放置1h、2h、4 h后，99mTc-TP1724的RCP分别为（95.74±1.53）%、（95.50±2.06）%与（93.64±2.25）%。99mTc-TP1724一步法标记冻干试剂盒4℃保存12周，标记率均稳定在90%以上。温育99mTc-TP1724和正常人的血清，Sephadex G50柱层析结果表明：实验组的主放射峰形状与对照组的主放射峰形状基本上保持一致，保留时间均出现在第42管；实验组在第16管左右出现小蛋白结合放射峰，约占6.61%。HPLC显示：TP1724的保留时间和99mTc-TP1724洗脱液RP的时间基本上一致(大约10 min)。半胱氨酸置换实验显示，未结合99mTc与对照组相比无明显增加。标记多肽脂/水分配系数lg P为－(1.99±0.02)。
　　3．正常大耳兔体内示踪动力学实验：家兔血液平均放射性浓度-时间数据经 DSA3.1.6软件智能化分析判定，99mTc-TP1724的示踪动力学符合权重为1的二室模型；分布半衰期 t1/2α为(2.64±1.32)min，消除半衰期 t1/2β为(78.36±13.38)min，CL(清除率)为(122.15±56.33)ml/min。
　　4．正常大耳兔体内SPECT显像：心脏、肝脏及双肾在1 min左右清晰显影，双肾和肝脏的影像随着时间渐渐地减弱；在5 min时大耳兔的膀胱开始显影，随着时间显著增强；0.5h时心脏、软组织放射性浓聚影大幅度消退，胆囊这时放射性浓聚影出现，肠道出现节段性很少的放射性分布；胃区在整个显像过程中表现为放射性缺损区，脑部表现为低放射本底影，颈部（包括甲状腺区）未见异常放射性浓聚影。
　　5．正常昆明小鼠体内生物分布研究：99mTc-TP1724经小鼠尾静脉注射后，1h时相的血液放射性比1 min时相下降了98.43%，而肾脏放射性下降82.14%；肝脏放射性10 min时开始下降，在0.5h时肠道的放射性开始增加；心脏、骨及肺脏的放射性快速地减少，大概在1h后与肌肉接近；脑部表现为持续性、低放射性分布。
　　6．大耳兔炎症模型显像：炎症灶在0.5h左右开始显影，ROI技术分析0.5h、1h、2h、3h、4h和5 h的炎症侧/对照侧（T/NT）的放射性比值分别为2.19±0.12、2.17±0.11、2.05±0.13、2.02±0.15、1.96±0.19与1.68±0.21。
　　结论：
　　1．本课题研究制备99mTc-TP1724的方法简单、易操作，保证标记率＞95%（间接法标记），不需要分离纯化，可以直接应用；易于制备一步法标记冻干试剂盒，便于临床推广应用；
　　2．标记率和比活度高，符合受体体内外研究要求；血液中快速清除，大部分排泄是经过泌尿系统；稳定性好、体内动力学性质优良。为进一步开展 VPAC1阳性肿瘤显像实验研究奠定了基础。

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第一章 前 言

第二章 99mTc-TP1724制备及其性质鉴定

2.1 99mTc-TP1724制备

2.2 99mTc-TP1724的性质鉴定

2.3 讨论

第三章 99mTc-TP1724动物体内实验研究

3.1 99mTc-TP1724正常大耳兔体内示踪动力学研究

3.2 99mTc-TP1724正常大耳兔体内SPECT显像

3.3 99mTc-TP1724正常小鼠体内生物分布实验

3.4 99mTc-TP1724大耳兔炎症模型显像

全文结论

参考文献

文献综述: 血管活性肠肽及其受体在多种肿瘤中的研究进展

攻读硕士期间发表的论文情况

致谢