50Hz低频电磁辐射(EMF)与5-氟尿嘧啶联合应用对乳腺癌MCF-7细胞的杀伤作用及其机制研究

摘要

乳腺癌主要发生在乳腺腺上皮组织，严重危害妇女健康。手术治疗是乳腺癌患者首选的治疗方式，然后采用术后放射治疗、化学治疗等方式。5-FU作为广谱化疗药物，具有疗效明确、价格低廉等优势，过去六十多年的临床实践表明具有很好的抗癌活性，可以用于消化道癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌等的治疗。但5-FU有胃肠道反应和骨髓抑制等副反应，且随着5-FU的长期使用，患者对5-FU的敏感性下降，因此，迫切需要有效的方式来提高5-FU的治疗效果和减少副反应。由于5-FU是特异性作用于细胞S期，所以提高细胞S期的分布比例，就有可能提高5-FU的治疗效果和降低5-FU的副反应。极低频场辐射(extremely lowfrequency-electromagnetic fields，ELF-EMF，0-300Hz)被认为是最能影Ⅱ向生物电活动的电磁场辐射。ELF-EMF可以引起早期基因的转录水平变化，影响细胞的基本生理过程，如细胞凋亡和细胞增殖。通过设置特定频率的电磁辐射可以影响癌细胞的增殖，进而影响药物的疗效。为此有理由推测，ELF-EMF与5-FU联合应用有望提高抗乳腺癌效果。
　　本课题即先采用ELF-EMF预处理乳腺癌MCF-7细胞和正常乳腺上皮MCF10A细胞，然后再给予5-FU处理的策略。通过MTT和流式细胞技术观察ELF-EMF和5-FU对乳腺癌细胞的杀伤作用;并进一步通过EdU、DAPI染色、PCR和WB等分子生物学方法探讨了ELF-EMF和5-FU联合应用增强5-FU对乳腺癌细胞杀伤作用的可能分子机制。
　　方法和结果:
　　第一部分:ELF-EMF与5-FU的联合应用对乳腺癌细胞的杀伤作用
　　目的:探讨ELF-EMF与5-FU的联合应用对乳腺癌细胞的杀伤作用。方法:将乳腺癌MCF-7和正常乳腺上皮MCF10A细胞分别分为5-FU单用对照组和50Hz-EMF与5-FU联合应用组，50Hz-EMF与5-FU联合应用组暴露于1mT的50Hz-EMF，5-FU单用对照组未给予暴露处理，然后两组同时给予5-FU培养24h。采用MTT检测MCF-7和MCF10A细胞的存活率;采用AnnexinⅤ和7AAD染色的流式细胞技术评价MCF-7和MCF10A细胞的存活情况。结果:与5-FU单用对照组相比，先选用1mT的50Hz-EMF对细胞进行暴露处理12h，然后使用10μM的5-FU刺激，可以明显降低50Hz-EMF与5-FU联合应用组细胞存活率，说明50Hz-EMF与5-FU的联合应用可以增强对MCF-7细胞的杀伤作用;并且，AnnexinⅤ和7AAD流式染色同样证实50Hz-EMF与5-FU的联合应用可以降低MCF-7细胞的存活;但与5-FU单用对照组相比，50Hz-EMF与5-FU的联合应用并不能增强5-FU对MCF10A细胞的杀伤作用。
　　第二部分:50Hz-EMF增强5-FU对乳腺癌细胞杀伤作用的机制研究
　　目的:探讨50Hz的ELF-EMF增强5-FU对乳腺癌细胞杀伤作用的可能机制。方法:1.观察50Hz-EMF对MCF-7细胞凋亡的影响。将MCF-7和MCF10A细胞分别分为对照组和50Hz-EMF组，50Hz-EMF组暴露于1mT的50Hz-EMF，对照组未给予暴露处理。采用流式细胞技术分析50Hz-EMF对MCF-7和MCF10A细胞的凋亡的影响。采用qRT-PCR技术对MCF-7和MCF10A细胞中Bax和Bcl-2的基因表达情况进行检测。采用Western Blot技术对MCF-7和MCF10A细胞的Caspase-3和Cleaved-Caspase-3蛋白表达情况进行检测。2.观察50Hz-EMF对MCF-7细胞周期的影响。采用EdU和DAPI染色快速统计MCF-7和MCF10A细胞DNA合成的情况;采用流式细胞技术分别分析MCF-7和MCF10A细胞周期分布情况，采用Western Blot分别检测MCF-7和MCF10A细胞的Cyclin E和Cyelin D1的蛋白表达情况，采用qRT-PCR检测MCF-7细胞的p53、Cyclin E、p21和Cyclin D1的基因表达情况。结果:1.50Hz-EMF对MCF-7细胞凋亡无明显影响。与对照组相比，流式技术结果显示1mT的50Hz-EMF刺激后对MCF-7和MCF10A细胞的凋亡均无明显影响;并且，qRT-PCR结果显示50Hz-EMF刺激后Bax和Bcl-2的基因表达也未发生明显的改变;Western Blot结果进一步显示50Hz-EMF刺激后MCF-7和MCF10A细胞Caspase-3和Cleaved-Caspase-3的蛋白表达未发生明显的改变。2.50Hz-EMF促进MCF-7细胞Cyclin E和Cyclin D1表达、增加MCF-7细胞在S期的比例。与对照组相比，1mT的50Hz-EMF可以促进MCF-7细胞的Cyclin E和Cyclin D1的mRNA(p＜0.05)及蛋白表达(p＜0.05);流式细胞周期检测发现50Hz-EMF刺激后MCF-7细胞在S期的比例增加(p＜0.05);EdU染色结果显示50Hz-EMF刺激后MCF-7细胞DNA合成明显增加。文献报道5-FU抗肿瘤的作用主要与特异性作用于细胞周期S期相关，因此，50Hz-EMF增强5-FU对MCF-7细胞杀伤作用的机制与其促进Cyclin E和Cyclin D1表达、增加MCF-7细胞在S期的比例有关。
　　本文结论:
　　1.1mT的50Hz-EMF暴露12h，可以增强5-FU对乳腺癌MCF-7细胞的杀伤作用。
　　2.50Hz-EMF暴露12h增强对乳腺癌MCF-7细胞的杀伤作用的机制与促进MCF-7细胞的Cyclin E和Cyclin D1的mRNA及蛋白表达、增加S期细胞有关，而与凋亡无明显关系。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 50Hz-EMF与5-FU联合应用对乳腺癌细胞的杀伤作用

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

第三章 50Hz-EMF增强5-FU对乳腺癌细胞杀伤作用的机制研究

3．1．1 材料和方法

3．1．2 结果

3．1．3 讨论

3．2 50Hz-EMF对乳腺癌细胞周期的作用

3．2．1 材料与方法

3．2．2 结果

3．2．3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述

攻读学位期间的研究成果

致谢