67kDa层粘素受体下调MICA/B诱导胆管癌细胞逃逸NK细胞杀伤的分子机制

摘要

目的：
　　研究胆管细胞癌67KDa层粘素受体(67LR，67kDa laminin receptor)下调入主要组织相容复合体Ⅰ类分子相关蛋白A/B(MICA/B)的表达，诱导对NK细胞杀伤的逃逸作用及分子机制。
　　方法：
　　对101例经手术切除的胆管癌石蜡标本，进行67LR和MICA、MICB的免疫组织化学染色，检测胆管癌67LR和MICA/B的表达情况。通过在胆管癌细胞中转染MICA/B的shRNA和过表达慢病毒，以干预MICA/B的表达，检测与NK细胞对与之共培养的胆管癌细胞的杀伤率。通过在胆管癌细胞中转染67LR的shRNA和过表达慢病毒，检测MICA/B的表达变化和NK细胞对胆管癌细胞的杀伤率。通过干预胆管癌细胞67LR的表达，检测其ADAM9的表达，并测定胆管癌细胞培养上清中sMICA/B的含量。
　　结果：
　　1.免疫组织化学与胆管癌临床病例特征相关性分析
　　1.1 67LR在27.7％(28/101)胆管癌组织中呈高表达，67LR的高表达与胆管癌分化程度。
　　(P=0.010)、胆管癌T分级(P=0.017)、淋巴结转移(P=0.000)、以及TNM分期(P=0.042)显著相关，提示67LR的高表达与胆管细胞癌的侵袭转移特性显著相关。
　　1.2 Kaplan-Meier分析提示67LR的高表达与胆管癌患者较差的生存时间(P=0.0001)和无瘤生存时间(P=0.0002)密切相关。
　　1.3 MICA在39.6％（40/101）胆管癌组织中呈低表达，而54.5％(55/101)胆管癌中MICB呈低表达。MICA、MICB低表达分别与胆管癌的分化程度（P=0.020，P=0.020）、胆管癌T分级(P=0.000，P=0.042)、淋巴结转移(P=0.001，P=0.002)、以及TNM分期(P=0.000，P=0.001)显著相关，提示MICA/B低表达与肿瘤侵袭转移特性显著相关。
　　1.4 Kaplan-Meier分析提示胆管细胞癌MICA的低表达与患者较差的生存时间(P=0.0001)和无瘤生存时间显著相关(P=0.0001);胆管癌细胞MICB的低表达与患者较差的生存时间(P=0.0001)和无瘤生存时间(P=0.0002)显著相关。
　　1.5 免疫组化结果提示67LR的表达量与MICA/B的表达量呈负相关（r=-0.419，P=0.000;r=-0.443,P=0.000）。
　　2.通过RT-PCR、WB、FCM、ELASIA、NK细胞毒性试验等探讨胆管癌细胞逃逸NK细胞杀伤的机制。
　　2.1 体外实验中通过干预MICA/B的表达，发现过表达MICA/B的胆管癌细胞与健康人NK细胞共培养，发现NK细胞对其杀伤作用显著增强;利用shRNA片段干扰胆管癌细胞MICA/B的表达，发现健康人NK细胞对其杀伤作用减弱。
　　2.2 通过干预胆管癌细胞67LR的表达，发现胆管癌细胞过表达67LR后，健康人NK细胞对胆管癌细胞的杀伤作用显著降低，而shRNA干扰67LR后，健康人NK细胞对其杀伤作用增强。
　　2.3 在体外实验中发现胆管癌细胞67LR可在mRNA水平和蛋白水平下调MICA/B的表达量，从而实现癌细胞逃逸NK细胞的杀伤作用。在小鼠肝原位种植模型中，发现ex-67LR组(1.36±0.23cm)原位肿瘤直径显著大于ex-CONTROL组(0.5±0.08cm)，前者易发生肝内转移。
　　2.4 初步探讨了在蛋白水平67LR可通过上调ADAM9剪切膜分子MICA/B，实现下调胆管癌细胞MICA/B的表达，从而促进胆管癌的发生与远处转移。
　　结论：
　　胆管癌67LR可通过下调MICA/B的表达量，而逃逸NK细胞监视，从而促进癌细胞的体内存活和早期远处转移。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 胆管癌中67LR、MICA、MICB的表达与临床病理特征的相关性研究

2．1 材料与方法

2．2 实验结果

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 胆管癌MICA／B的异常表达对NK细胞杀伤作用的影响

3．1 材料与方法

3．2 实验结果

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 胆管癌67LR下调MICA／B逃逸NK细胞杀伤的分子机制

4．1 材料与方法

4．2 实验结果

4．3 讨论

4．4 小结

全文总结

参考文献

文献综述 靶向NK细胞的肿瘤免疫治疗

硕士期间论文发表情况

致谢