低氧抑制MCF-7细胞中信号素3A表达并调控成骨前体细胞分化的研究

摘要

目的：
　　乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，在晚期易转移至脑、肝脏、骨骼等器官和系统，患者一旦发生骨转移，即宣告了疾病的不可治愈。乳腺癌骨转移最常见于脊柱，且多为溶骨性骨破坏，造成骨量丢失和病理性骨折，引起患者疼痛、高钙血症、瘫痪等一系列并发症，严重影响患者的预后和生存质量。因此，临床上急需行之有效的方法来治疗和预防溶骨性骨破坏，与此同时，明确乳腺癌溶骨性破坏的作用机制有利于为临床上新型药物和治疗手段的开发提供基础支持。
　　信号素3A(semaphorin3A，Sema3A)是神经发育过程中的导向因子之一，随着对其认识的逐渐加深，其在骨代谢领域的研究也有了突破性的进展。Sema3A作为一种“骨保护因子”能够促进成骨前体细胞分化成熟，增加骨密度;同时抑制破骨细胞分化，减少骨吸收作用。虽然Sema3A在生理状态下骨代谢中的作用较为明确，但对其病理状态下的研究甚少。
　　由于肿瘤转移灶代谢相对活跃，而血管生成速度相对滞后，其微环境均存在一定程度的缺氧。以往的研究表明，低氧作为肿瘤发生和发展过程中的一种危险因素，能够加速肿瘤的变异、生长、侵袭和转移。体外低氧环境作为上游因素，能通过多种因子调控肿瘤细胞的生物学功能。本研究猜想，Sema3A可能作为低氧诱导下的信号分子之一，参与乳腺癌骨转移骨破坏的调节，通过体外低氧刺激乳腺癌MCF-7细胞，研究常氧与低氧条件下收集MCF-7的细胞条件培养液对小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1分化能力的影响，并探讨Sema3A的表达对低氧调控乳腺癌骨转移中成骨前体细胞分化的作用与机制。
　　方法：
　　一、低氧MCF-7条件培养液对成骨前体细胞分化的影响。
　　1.收集乳腺癌MCF-7细胞在常氧和低氧条件下培养48h后的条件培养液;
　　2.采用碱性磷酸酯酶(alkaline phosphatase，ALP)活性检测试剂盒和BCIP/NBT ALP显色试剂盒检测MC3T3-E1细胞中ALP的活性;
　　3.采用茜素红S(alizarin red S，ARS)染色检测MC3T3-E1细胞矿化情况。
　　二、低氧对MCF-7细胞中Sem a3A表达的影响。
　　1.采用实时荧光定量PCR法检测在常氧和低氧条件下培养0、12、24和48h后乳腺癌MCF-7细胞中Sema3A的mRNA表达变化;
　　2.采用蛋白印迹法检测在常氧和低氧条件下培养0、12、24和48h后乳腺癌MCF-7细胞中Sema3A的蛋白表达变化。
　　三、低氧诱导因子对MCF-7细胞Sema3A表达的调控。
　　1.利用shRNA慢病毒构建HIF-1α和HIF-2α低表达的MCF-7细胞系，并确定干扰效率;
　　2.采用实时荧光定量PCR法检测转染病毒后MCF-7细胞中Sema3A的mRNA表达随时间的变化;
　　3.采用蛋白印迹法检测转染病毒后MCF-7细胞中Sema3A的蛋白表达随时间的变化。
　　四、外源性Sema3A对成骨前体细胞分化的影响。
　　1.将重组人Sema3A(recombinant human semaphorin3A，rhS ema3A)加入到低氧条件培养液诱导的MC3T3-E1细胞中;
　　2.采用BCIP/NBT ALP显色试剂盒检测MC3T3-E1细胞中ALP的活性;
　　3.采用茜素红S（alizarin red S，ARS）染色检测MC3T3-E1细胞矿化情况。
　　4.实时荧光定量PCR法检测MC3T3-E1细胞中ALP、Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor2，RUNX2)、骨钙蛋白(osteocalcin，OCN)和转录因子Osterix(Osx)的mRNA表达水平。
　　结果：
　　一、低氧MCF-7条件培养液对成骨前体细胞分化的影响。
　　1.相比于常氧条件下获得的MCF-7条件培养液(NorCM)组，低氧条件培养的MCF-7条件培养液(HyCM)组可以使MC3T3-E1细胞的ALP活性明显减弱(P＜0.05);
　　2.ARS染色显示，HyCM组比NorCM组钙化面积明显减小(P＜0.05)。
　　二、低氧对MCF-7细胞中Sema3A表达的影响。
　　低氧条件下处理MCF-7细胞24h和48h后，细胞中Sema3A的mRNA和蛋白的表达水平明显低于常氧条件下相同时间点的Sema3A表达水平（P值均＜0.05）。
　　三、低氧诱导因子对乳腺癌细胞Sema3A表达的调控。
　　1.HIF-1α和HIF-2αshRNA可分别有效干扰乳腺癌MCF-7细胞HIF-1α和HIF-2α的表达（P值均＜0.05）;
　　2.干扰HIF-1α表达后，MCF-7细胞Sema3A的mRNA和蛋白表达在低氧诱导下与常氧诱导相比无明显变化;
　　3.干扰HIF-2α表达后，在低氧诱导下12、24和48h的MCF-7细胞中Sema3A的mRNA和蛋白的表达水平明显低于常氧条件下相同时间点的Sema3A表达水平(P值均＜0.05)。
　　四、外源性Sema3A对成骨前体细胞分化的影响。
　　1.相比于HyCM组，HyCM+S ema3A组MC3T3-E1细胞的ALP活性及ARS染色明显增强（P值均＜0.05）;
　　2.加入rhSema3A的HyCM组，其分化早期（RUNX2、ALP）和分化晚期(OCN、Osx)的mRNA表达较HyCM组之前的表达明显升高（P值均＜0.05）。
　　结论：
　　1.低氧MCF-7条件培养液比常氧MCF-7条件培养液诱导成骨前体细胞分化能力显著降低;
　　2.低氧下调乳腺癌MCF-7细胞中成骨保护因子Sema3A的表达，与时间呈相关性;
　　3.低氧可能通过HIF-1α而非HIF-2α调控乳腺癌细胞MCF-7Sema3A的表达;
　　4.外源性Sema3A蛋白可拮抗低氧MCF-7条件培养液的成骨分化抑制作用。

目录

声明

缩略语表

摘要

前言

材料与方法

2．1 细胞株

2．2 主要仪器

2．3 主要试剂

2．4 部分溶液主要配方和操作

2．5 实验方法

结果

3．1 肿瘤常氧或低氧条件培养液对MC3T3-E1的分化能力的影响

3．2 低氧对MCF-7细胞Sema3A表达的影响

3．3 低氧诱导因子对乳腺癌细胞Sema3A表达的调控

3．4 外源性rhSema3A蛋白对低氧条件培养液诱导成骨分化的影响

讨论

全文结论

参考文献

文献综述 信号素3A在骨科相关基础和临床研究进展

硕士期间发表的文章

致谢