LASER通过HNF-1α-PCSK9调控胆固醇代谢及zonulin易化肠道细菌移位致动脉硬化的研究

摘要

本文主要从以下几个部分进行论述：
　　第一部分 LASER通过HNF-1α-PCSK9途径调控肝脏胆固醇代谢
　　背景：
　　高脂血症是动脉硬化性心血管疾病最重要的危险因素之一。血脂水平与许多因素有关，其中遗传变异是研究热点。全基因组关联分析发现许多基因的单核昔酸多态性与血脂水平相关，这些变异可以解释约10-12％的变异幅度。然而约43％的变异位于基因间的非编码区域，其功能尚不清楚。最近的研究发现基因的非编码区域可以转录出众多的非编码RNA，而长链非编码RNA更易于分布在疾病相关的全基因组关联区域。如9p21编码ANRIL并与PRC2蛋白结合而调控下游基因的表达。因此，我们提出脂蛋白相关的关联分析区域同样可以编码lncRNA并调控脂代谢。
　　目的：
　　研究肝脏中是否存在调控脂代谢的lncRNA。
　　方法：
　　以qRT-PCR的方法测定外周白细胞中LASER的表达。以RNA干扰的方法降低HepG2细胞内LASER的表达后，以酶法或Filipin染色测定细胞内胆固醇水平，以基因芯片分析干扰LASER后有哪些基因发生了改变。RNA-蛋白质间的相互作用通过RNA免疫共沉淀证实，HNF-1α基因启动子区域的组蛋白甲基化通过染色质免疫共沉淀检测。
　　结果：
　　我们在血脂相关多态性热点区域鉴定了一个lncRNA(LASER)。临床研究发现LASER的表达与含胆固醇的脂蛋白及PCSK9含量呈正相关。降低LASER的表达后可以降低细胞内胆固醇水平并影响胆固醇代谢的相关基因，其中PCSK9及其转录因子HNF-1α的表达均下降。同时，在给予HNF-1α的天然的拮抗剂黄连素后可以阻断LASER对PCSK9的作用。LASER通过在核内与CoREST/REST蛋白复合体的LSD1结合干扰了LSD1的活性，从而导致HNF-1α基因启动子抑制性的H3K4me2增加。与此同时，降低LSD1的表达则可以阻断LASER对HNF-1α-PCSK9的作用。最后，我们发现他汀类可以升高LASER的表达，同时导致PCSK9增加，胆固醇可以反向激活LXR受体调控LASER的表达。我们的研究可能部分解释了“他汀逃逸”的现象。
　　结论：
　　我们发现一个新的调控肝脏胆固醇代谢的lncRNA-LASER。而抑制LASER可与他汀协同发挥联合调脂的效应。
　　第二部分 Zonulin易化肠道细菌移位参与动脉硬化的机制研究
　　背景：
　　动脉硬化性心血管疾病导致的死亡仍高居不下，其中炎症激活在动脉硬化的进展中发挥了重要的作用。大量的流行病学研究发现冠心病的发生与多种病原微生物相关（肺炎衣原体、幽门螺杆菌及巨细胞病毒等）。肠道中存在着种类众多的共生菌。肠道共生菌可以通过磷脂酰胆碱和左卡尼汀的代谢而间接致动脉硬化，但目前仍缺乏肠道微生物直接致动脉硬化的直接证据。约95％的动脉硬化斑块中能检测到细菌的16SrRNA基因成分，其中以肠杆菌科为主。同时，我们前期发现冠心病人全血中肠道菌属的荧光假单胞菌及沙雷氏菌含量增加，提示除了间接作用外，肠道细菌还可能直接参与了动脉硬化的进展。
　　生理状况下肠道间的紧密连接将肠道细菌与循环隔绝开来，在动脉硬化等病理情况下细菌能否穿过肠道屏障并进入动脉硬化斑块内目前尚不清楚。肠道细胞间的紧密连接在决定肠道通透性及控制肠道细菌移位方面发挥了重要的作用，其中zonulin（连蛋白）是肠道细胞合成的分泌蛋白，在调节紧密连接开放和决定肠道细胞通透性方面发挥了重要的作用。既往研究表明循环中zonulin的水平在糖尿病、肥胖等动脉硬化的危险因素中升高。
　　目的：
　　动脉硬化的发生和发展中，是否也有zonulin的改变，而zonulin调控的肠道通透性改变是否参与了肠道细菌的移位呢？
　　方法：
　　以ELISA的方法测定血浆中的zonulin含量。体外培养Caco2细胞层构建肠上皮屏障模型，培养荧光假单胞菌并以菌液干预肠上皮屏障模型。于不同时间点取Transwell小室的上层及下层的培养基进行细菌培养，并照相记录菌落生长情况。以扫描电镜观察荧光假单胞菌暴露对肠上皮屏障结构的影响，以激光共聚焦显微镜观察对zonulin分泌的影响。
　　结果：
　　冠心病人中血浆中zonulin含量增加，而荧光假单胞菌的暴露促进了肠道上皮细胞内zonulin的分泌。分泌的zonulin改变了肠上皮屏障的细胞结构，导致肠道紧密连接的开放而促进荧光假单胞菌在肠道上皮的移位。
　　结论：
　　荧光假单胞菌可以促进zonulin的分泌并易化肠道细菌移位。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一部分 LASER通过HNF-1α-PCSK9调控胆固醇代谢

第一章 肝脏表达LASER并调控胆固醇代谢

1．1 材料和方法

1．2 结果

1．3 讨论

1．4 小结

第二章 LASER调控HNF-1α-PCSK9表达的分子机制研究

2．1 材料和方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 小结

第二部分 Zonulin易化肠道细菌移位参与动脉硬化的机制研究

3．1 材料和方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 小结

全文结论

参考文献

文献综述 非编码RNA在胆固醇代谢中的研究进展

攻读学位期间的研究成果

致谢