远志皂苷调节线粒体自噬在抗Aβ诱导细胞损伤中的作用及机制

摘要

中药远志（Polygalae radix）具有抗痴呆、脑保护、镇静、抗抑郁、保护心脑血管等作用，其主要活性成分细叶远志皂苷（tenuifolin，Ten）可通过多种途径发挥其神经保护作用，具有抗氧化应激、抗衰老、抑制细胞凋亡、增进认知等作用，还可通过自噬途径减少AD模型细胞Aβ的分泌。我们前期的研究发现，Ten可通过降低ROS、MDA并提高SOD、GSH-Px浓度或活性，减轻Aβ诱导的细胞氧化应激损伤；通过上调Bcl-2/Bax比值，抑制caspase凋亡蛋白的表达，降低细胞凋亡率；通过调控RAGE、LRP1蛋白表达，改善Aβ的转运及清除能力；通过调节细胞周期蛋白的表达水平，防止神经细胞周期紊乱，从而对神经细胞起到保护作用。目前，随着Ten的神经保护作用的研究不断深入，其作用的分子机制及相关的信号通路的研究仍有待进一步阐明。本论文探讨了Ten通过调节线粒体自噬在抗Aβ诱导的SH-SY5Y细胞损伤中的作用及机制，阐明其调节线粒体自噬作用的信号途径，为进一步研究细胞自噬在Ten抗阿尔茨海默病中的作用及机制提供实验依据。具体内容如下：
　　1.Ten对Aβ诱导的SH-SY5Y细胞活力和凋亡率的作用研究。MTT法检测细胞活力，25、50μM的Ten能显著增加细胞活力，Aβ显著降低细胞活力的最小剂量是20μM， Ten（25-200μM）组细胞活力显著高于Aβ（20μM）模型组，其中50、100μM剂量的Ten具有最佳的保护效应。结果表明，Ten50、100μM处理组都明显降低了Aβ诱导的SH-SY5Y细胞凋亡率，其中50μM剂量的Ten作用最显著，选用50μM的Ten及20μM的Aβ用于后续实验。
　　2.Ten对Aβ诱导的SH-SY5Y细胞线粒体损伤的作用研究。JC-1检测Δψm的变化，Δψm较高时，JC-1聚集形成聚合物，产生红色荧光，否则产生绿色荧光，Aβ诱导的SH-SY5Y细胞红色荧光明显降低，绿色荧光明显增加，红色荧光向绿色荧光转变比较明显；而经Ten和CsA处理后，红色荧光向绿色荧光转变的趋势被抑制。Western blot检测Cyt c的变化，Ten和CsA组能明显抑制Aβ诱导的Cyt c的蛋白表达。caspase-3和caspase-9酶活力的测定及qPCR法检测其mRNA的表达水平，Ten和siRNA组明显抑制了Aβ诱导的caspase-3和caspase-9酶活力及mRNA的表达。结果表明，Ten和CsA或siRNA组可明显抑制Aβ诱导的细胞Δψm降低、Cyt c释放、caspase-3和caspase-9酶活力及mRNA的表达增加。
　　3.Ten对Aβ诱导的SH-SY5Y细胞线粒体自噬作用及机制的研究。MDC染色观察Ten处理组明显减弱了Aβ诱导的SH-SY5Y细胞荧光强度增强。Western blot检测自噬标志性蛋白LC3的变化，Ten和CsA组明显抑制了Aβ诱导的LC3-II/I的增加。MTG和LTR染色检测细胞线粒体溶酶体共定位情况，Ten、CsA和Ten+CsA组明显抑制了Aβ诱导红绿荧光共定位增加。qPCR法检测PINK1和Parkin的mRNA的表达水平， Ten和siRNA组明显抑制了Aβ诱导PINK1和Parkin mRNA的表达水平。结果表明，Ten和CsA或siRNA组可抑制Aβ诱导的细胞自噬体、LC3-II/I及线粒体自噬的增加。
　　综上所述，Ten能增强Aβ诱导的细胞活力，降低细胞凋亡率；减少线粒体损伤，增加Δψm并减少Cyt c的释放，抑制caspase-3和caspase-9酶活力及mRNA的表达；降低自噬小体及LC3-II/I蛋白表达和线粒体溶酶体共定位，降低PINK1和Parkin mRNA的表达水平。研究表明，Ten通过Aβ诱导PINK1/Parkin途径激活的抑制，来发挥调节LC3的表达以及减少Cyt c的释放，进而抑制caspase酶活性，从而降低Aβ诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。本论文研究了Ten通过调控线粒体自噬抑制线粒体凋亡途径发挥抗Aβ诱导的凋亡的保护机制，探讨了Ten在抗Aβ神经毒性及神经细胞保护中的作用，为研究针对Aβ或AD的药物提供理论依据。

目录

声明

前言

一、研究背景

二、研究目的及意义

三、研究内容

第一章 远志皂苷对Aβ诱导SH-SY5Y细胞损伤的作用研究

一、前言

二、实验材料

三、实验方法

四、结果

五、讨论

第二章 远志皂苷对Aβ诱导SH-SY5Y细胞线粒体损伤的作用研究

一、前言

二、实验材料

三、实验方法

四、结果

五、讨论

第三章 远志皂苷调节线粒体自噬抗Aβ神经毒性作用的机制研究

一、前言

二、实验材料

三、实验方法

四、结果

五、讨论

总结

参考文献

主要英文缩写词表

攻读硕士期间发表的论文

致谢