自噬/线粒体自噬在锌诱导的抗心肌细胞缺氧/复氧损伤保护中的作用

摘要

目的:
　　1.观察ZnCl2是否通过诱导自噬/线粒体自噬来减轻心肌细胞缺氧/复氧引起的活性氧（ROS）产生并保护心肌细胞。
　　2.探讨ZnCl2诱导自噬/线粒体自噬的分子机制。
　　方法:
　　建立心肌细胞H9c2缺氧/复氧模型。用透射电镜观察线粒体的结构和功能改变、线粒体自噬泡的形成情况；Western blotting法检测LC3、TOM20、TIM23、COX4、Beclin1、PINK1蛋白表达及ERK、mTOR、AMPK、Bcl-2磷酸化水平；qPCR检测NIX和PINK1 mRNA水平的改变；用免疫荧光法检测GFP-LC3自噬体和TOM20的共定位、Mitotrack Green（MTG）和PINK1的共定位；用线粒体荧光探针JC-1、ROS荧光探针DCFH-DA、线粒体ROS荧光探针Mitosox Red在共聚焦显微镜上分别测定线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential，△Ψm）、细胞内总ROS和线粒体ROS水平。
　　结果:
　　1.共聚焦显微镜实验结果显示。与正常对照组相比，复氧时细胞和线粒体内的ROS明显增加。用ZnCl2处理细胞可减少ROS水平，表明ZnCl2可减少复氧时线粒体ROS的产生。
　　2.在正常生理条件下，H9c2细胞经不同浓度的ZnCl2处理后，LC3-Ⅱ水平均明显升高，其中以5μM最为明显。用GFP-LC3质粒转染H9c2细胞48 h后，用ZnCl2处理细胞使GFP-LC3荧光明显增强。另外Rapamycin（20μM）和饥饿（8 h）也使LC3-Ⅱ水平升高，这种作用可被选择性ZnCl2螯合剂TPEN所逆转。这些结果表明内源性和外源性 ZnCl2均参与自噬。另外自噬流抑制剂BafilomycinAl（BA1）可进一步促使LC3-Ⅱ水平升高，表明ZnCl2可增加自噬流。
　　3.免疫荧光实验结果显示，用GFP-LC3质粒转染H9c2细胞48 h后，ZnCl2使GFP-LC3自噬体与线粒体外膜蛋白TOM20的共定位明显增加，表明在生理条件下ZnCl2可诱导线粒体自噬。电镜检查结果显示，未经处理的细胞，线粒体正常分布于细胞内，用锌离子处理细胞30 min后，部分线粒体被自噬体包裹。Western blotting分析结果显示线粒体标志性蛋白包括外膜蛋白TOM20、内膜蛋白TIM23和COX4的表达均下降，进一步证明ZnCl2可诱导线粒体自噬。
　　4.在缺氧/复氧条件下，ZnCl2增加GFP-LC3自噬体与线粒体外膜蛋白TOM20的共定位。电镜结果显示，缺氧/复氧使线粒体断裂，线粒体移位，空泡化增多，可见自噬体；而ZnCl2处理组，线粒体水肿空泡化减少，自噬体，自噬溶酶体，自噬体包裹线粒体增多。另外，ZnCl2使TOM20、TIM23和COX4的表达均降低，使LC3-II水平明显升高，表明复氧时ZnCl2可促进线粒体自噬，清除损伤的线粒体。
　　5.在缺氧/复氧模型中，ZnCl2处理H9c2细胞后，TOM20、TIM23和COX4蛋白水平明显降低，而LC3-II水平则明显升高，ZnCl2的这些作用可被自噬抑制剂3-MA所抑制。同时，自噬抑制剂3-MA可抑制ZnCl2对细胞ROS和线粒体ROS的影响，表明ZnCl2通过诱导自噬/线粒体自噬发挥其抗氧化应激作用。
　　6.Western blotting结果显示，与缺氧/复氧组相比，ZnCl2促进ERK磷酸化，使LC3-II水平升高，促进TOM20、TIM23和COX4的降解。ZnCl2的这些作用可被MEK抑制剂PD98059所抑制，表明ERK信号通路参与ZnCl2诱导的自噬/线粒体自噬。在缺氧/复氧模型中，ZnCl2使Beclin1和LC3-II水平升高，使TOM20、TIM23和COX4表达下降，而这些作用被Beclin1 siRNA所抑制，表明Beclin1参与ZnCl2诱导的自噬/线粒体自噬。另外，PD98059可抑制ZnCl2对Beclin1表达和Bcl-2磷酸化的影响，表明在ZnCl2诱导自噬的过程中，ERK位于Beclin1和Bcl-2的上游。
　　7.在缺氧/复氧模型中，ZnCl2可促进线粒体TOM20、TIM23和COX4表达下降，而这些作用可被PINK1 siRNA所抑制。免疫荧光实验结果显示，ZnCl2使Mitotracker（MTG）与PINK1的共定位增加，而该效应被PD98059所阻断，表明PINK1参与ZnCl2诱导的线粒体自噬过程且可能位于ERK下游。
　　8.ZnCl2减少复氧时ROS水平，而该作用被Beclin1 siRNA和PINK1 siRNA所抑制，表明Beclin1和PINK1均参与ZnCl2的抗氧化应激作用。
　　9.ZnCl2可减少缺氧/复氧引起的线粒体膜电位的降低，增加细胞活性。ZnCl2的这种作用被Beclin1 siRNA和PINK1 siRNA所逆转，表明Beclin1和PINK1均参与ZnCl2抗缺氧/复氧损伤的保护作用。
　　结论:
　　1、ZnCl2可减轻心肌细胞复氧时ROS的爆发及氧化应激损伤，进而保护心肌细胞。
　　2、ZnCl2通过诱导心肌细胞自噬及线粒体自噬而清除损伤的线粒体，进而防止线粒体ROS的产生。
　　3、ZnCl2通过ERK、Beclin1及PINK1信号通路来诱导心肌细胞自噬/线粒体自噬。

目录

声明

缩略语

前言

研究现状、成果

目的和方法

一、观察锌离子是否通过诱导自噬/线粒体自噬而减少复氧时线粒体ROS的产生

1.1材料和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、 探讨锌诱导自噬/线粒体自噬的机制

2.1结果

2.2讨论

2.3小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述:自噬/线粒体自噬的分子机制及其在心肌缺血/再灌注损伤中的作用

致谢

个人简历