合浦珠母贝肉寡肽的制备及其抗氧化活性研究

摘要

合浦珠母贝(Pinctada martensii)是我国广西、海南、广东沿海主要的海水珍珠养殖贝类,采珠后产生大量的珍珠贝肉,珍珠贝肉含有丰富的活性物质。本文以合浦珠母贝肉为原料,通过酶解技术及超滤、凝胶层析、反相高效液相色谱等分离纯化技术制备具有抗氧化活性的合浦珠母贝肉寡肽,为合理、高值利用合浦珠母贝肉提供理论依据。
　　 以总抗氧化活性、DPPH自由基清除率、超氧阴离子清除率和羟自由基清除率为指标,在Alcalase2.4 L、枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶及风味蛋白酶五种蛋白酶适宜条件下水解合浦珠母贝肉,选择出最佳单酶。在此基础上运用响应面法优化最佳单酶的水解工艺,研究pH值、温度、酶底比(E/S)和水解时间对水解度与抗氧化活性的影响,建立水解度与抗氧化活性的数学模型。最后引用超声波辅助酶解技术再次优化贝肉水解工艺,以提高水解效率。结果表明,Alcalase蛋白酶水解产物具有较强的抗氧化能力,通过综合比较分析将其作单酶:响应面优化得到超声波辅助酶解的最佳水解工艺条件为:底物浓度(料水比W/V)为3:2(W/V),pH7.0,加酶量3.01％(W/W),61℃,超声波频率35 kHz、超声功率360 W处理1 h后,继续酶解0.5 h。在此条件下产物的水解度为33.8％,DPPH自由基清除率达到67.3％,平均肽链长度3.2,IC50为15.6 mg/mL。超声波辅助酶解可以大大提高水解率,缩短水解时间。
　　 采用超滤、凝胶层析以及反相高效液相色谱进行合浦珠母贝肉抗氧化活性寡肽的分离纯化,并采用基质辅助激光解吸离子化质谱测定和分析了抗氧化寡肽的分子量及其氨基酸序列。结果表明采用超滤进行膜分离的最佳条件为:操作压力3.5 bar,超滤温度5℃。经Sephadex G-25分离得到分子量分布范围为89～1437.5 Da的PMO,进一步经RP-HPLC纯化,通过MALDI-TOF-MS分析RP-HPLC分离各组分表明:RP-HPLC分离所得a组分分子量为1022.543 Da,b组分分子量为1334.660 Da,其氨基酸序列为:Arg-Gly-Glu-Arg-Arg-Asp-Gly-Tyr-Asn-Gly-Arg,c组分分子量为1494.761Da,其氨基酸序列为:Val-Ala-Thr-Gly-Leu-Arg-Lys-Glu-Gly-Val-Val-Gly-Gly-Pro-Arg,d组分分子量为1085.597 Da,e组分分子量为1288.819 Da和1304.828 Da,所对应的氨基酸序列分别为:Asn-Ala-Asp-Pro-Ala-Val-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Lys-Gly,Ala-Ala-Ala-Ser-Pro-Ser-Gly-His-Ala-Ala-Ser-Pro-Pro-Ala-Asn。
　　 最后对膜分离各段产物的DPPH自由基清除能力、超氧阴离子清除能力及羟自由基清除能力进行了比较,同时选择还原型GSH和Vc做PMO抗氧化活性对照,结果表明,膜分离产物中,PMO对三种自由基清除能力最强,DPPH自由基清除能力IC50值为11.1 mg/mL,,超氧阴离子清除能力IC50值为18.9 mg/mL,羟自由基清除能力IC50值为26.1 m/mL；5.23 mg/mL的PMO总抗氧化能力强于0.1％的Vc和1 mg/mL的还原型GSH。

目录

文摘

英文文摘

缩略词

1绪论

1．1研究目的及意义

1．2合浦珠母贝肉研究现状

1．3抗氧化活性肽的研究现状

1．3．1内源性抗氧化肽(肌肽、GSH)及其抗氧化活性研究

1．3．2抗氧化活性多肽及寡肽的研究进展

1．4分离纯化技术在功能活性物质中的应用

1．4．1超滤

1．4．2凝胶过滤层析

1．4．3离子交换层析

1．4．4反相高效液相色谱法(RP-HPLC)

1．4．5生物质谱技术

2合浦珠母贝肉制备抗氧化寡肽的酶解条件研究

2．1材料与方法

2．1．1原料

2．1．2主要试剂

2．1.3仪器及设备

2．1．4酶活力测定方法

2．1．5总氮含量的测定

2．1.6 BCA试剂盒测定法测定蛋白质浓度

2．1．7 甲醛滴定法测定游离氨基氮含量

2．1．8水解度(DH)的测定

2．1.9平均肽链长度(APCL)测定

2．1．10三氯乙酸中可溶性氮含量

2．1．11合浦珠母贝肉酶解产物总抗氧化活性测定

2．1．12合浦珠母贝肉酶解产物DPPH自由基清除能力测定

2．1．13合浦珠母贝肉酶解产物抑制邻苯三酚自氧化速率

2．1．14邻氮二菲法比色法测定清除羟自由基(·oH)能力

2．1．15水解酶的筛选试验

2．1．16合浦珠母贝肉酶解工艺条件优化

2．1．17超声波辅助合浦珠母贝肉酶解条件研究

2．2结果与分析

2．2．1酶的活力分析

2．2．2合浦珠母贝肉单酶酶解产物DH-AOA分析

2．2．3水解产物TCA-N的变化

2．2．4响应面法优化Alcalase酶解合浦珠母贝肉的工艺条件研究

2．2．5响应曲面分析及验证试验分析

2．2．6超声波辅助酶解合浦珠母贝肉的工艺技术研究

2．3本章小结

3合浦珠母贝肉抗氧化寡肽的分离纯化及结构研究

3．1材料与方法

3．1．1实验材料

3．1．2主要试剂

3．1．3主要仪器与设备

3．1．4合浦珠母贝肉酶解物(PMHs)的制备

3．1．5微滤及超滤

3．1．6葡聚糖凝胶分离纯化及分子量分布的初步测定

3．1．7 RP-HPLC分析抗氧化肽

3．1．8 MALDI-TOF分子量测定及结构分析

3．1．9合浦珠母贝肉寡肽氨基酸组成测定

3．2结果与分析

3．2．1膜分离条件的研究

3．2．2葡聚糖凝胶过滤色谱分离1 kDa膜分离寡肽混合物(PMO)

3．2．3 RP-HPLC分析抗氧化肽

3．2．4合浦珠母贝肉抗氧化寡肽的氨基酸组成

3．2．5 MALDI—TOF-MS分子量测定及结构解析

3．3本章小结

4合浦珠母贝肉寡肽的抗氧化效果研究

4．1材料与方法

4．1．1实验材料

4．1．2主要试剂

4．1．3主要仪器与设备

4．1．4蛋白质浓度测定BCA试剂盒测定法

4．1．5总抗氧化活性测定

4．1．6 DPPH自由基清除能力测定

4．1．7超氧阴离子清除能力测定

4．1．8羟自由基清除能力测定

4．1．9亚油酸过氧化反应

4．1．10红细胞氧化溶血实验

4．1．11酶切处理对寡肽抗氧化活性的影响

4．1．12吸湿保湿性实验

4．2结果与讨论

4．2．1膜分离各分子量段产物抗氧化效果分析

4．2．2 PMO总抗氧化能力及自由基清除能力分析

4．2．3抗亚油酸过氧化能力分析

4．2．4红细胞氧化溶血试验

4．2．5酶切处理对PMO抗氧化活性的影响

4．2．6 Sephadex G-25凝胶分离各组分的抗氧化活性分析

4．2．7分析经RP-HPLC纯化得到的各组分抗氧化能力

4．2．8吸湿性与保湿性研究

4．3本章小结

结论

论文创新点

参考文献

致谢

附录