成年大鼠类胰岛干细胞分离培养的研究

摘要

胰岛干细胞是一类存在于胎儿和成年胰岛内成体干细胞，具有自我更新和多分化潜能，其特点是在自然分化过程中分化形成胰岛组织的各种细胞。采用干细胞组织工程技术，体外分离克隆胰岛干细胞作为种子细胞，诱导其分化形成功能性胰岛细胞，并移植治疗糖尿病，是解决胰岛供体短缺的有效途径。
　　本试验对成年大鼠类胰岛干细胞的分离培养、FBS和四种生长因子对成年大鼠类胰岛干细胞体外增殖的影响、成年大鼠类胰岛干细胞的主要生物学特性及其致瘤性等方面进行了较为系统的研究，初步揭示了胰岛干细胞体外生长增殖的规律，建立了胰岛干细胞体外培养体系，为利用胰岛干细胞技术生产具有医用价值的生物材料提供了参考依据。本研究主要内容包括：
　　（1）成年大鼠类胰岛干细胞的分离培养
　　本试验以成年大鼠胰腺组织为材料，采用机械剪碎结合0.1％Ⅳ型胶原酶消化分离胰腺组织，DTZ染色，挑取胰岛细胞团，以RPMI-1640+10% FBS+10 mmol/L HEPES+71.5μmol/Lβ-巯基乙醇+1 mmol/L丙酮酸钠为基础培养基进行培养，获得原代上皮样成年大鼠类胰岛干细胞及少量的成纤维细胞。在传代过程中，逐渐纯化成年大鼠类胰岛干细胞。
　　成年大鼠胰岛干细胞生长至70%～80%融合时，形成铺路石样细胞单层。前3代类胰岛干细胞增殖较慢，通常培养7 d进行传代；第4代以后类胰岛干细胞迅速扩增，生长3～4 d就可对其传代。由第5代、第10代和第15代类胰岛干细胞生长曲线可知，细胞传代培养1d后就进入快速增殖期，1～4 d处于对数生长期，5～6 d处于平台期，7 d后增殖能力开始下降。从成年大鼠类胰岛干细胞传代情况看，该干细胞有较好体外增殖能力，现已传至30代并冻存。染色体核型分析结果显示，第30代的成年大鼠类胰岛干细胞染色体的数量（2n=42）和形状均与第1代的相同。
　　（2）FBS和四种生长因子对成年大鼠类胰岛干细胞体外增殖的影响
　　以RPMI-1640+10 mmol/L HEPES+71.5μmol/Lβ-巯基乙醇+1 mmol/L丙酮酸钠为基础培养液，分别添加不同浓度的FBS、EGF、bFGF、KGF或IGF-Ⅱ，探讨血清和不同生长因子对成年大鼠类胰岛干细胞增殖影响。结果显示，当FBS浓度为15%时，成年大鼠类胰岛干细胞增殖速度最快；在RPMI-1640+15% FBS+10 mmol/L HEPES+71.5μmol/Lβ-巯基乙醇+1 mmol/L丙酮酸钠的基础上，再添加10 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF、5 ng/mL IGF-Ⅱ或15 ng/mL KGF，均更有助于成年大鼠类胰岛干细胞增殖，且细胞在添加10 ng/mL bFGF的培养液中增殖速度最快。
　　（3）成年大鼠类胰岛干细胞的主要生物学特性及其致瘤性
　　随机取第15代成年大鼠类胰岛干细胞，进行细胞免疫荧光染色和流式细胞术检测。结果显示，第15代成年大鼠类胰岛细胞表达Ngn3、Nestin、Pax4、Pax6和Oct4，其阳性率分别为（90.6±3.2）%、（86.3±4.5）%、14.4%、7.7%和10.2%；不表达CK19、Somatostatin、CD15、Nanog、Sox2、CD117、Ptf1a、MafA和PCNA。
　　取第26代类胰岛干细胞，以1×107个细胞/只（0.2 mL）的量接种到4～6 w裸鼠的腋窝背部皮下，SPF环境饲养30 d，观察裸鼠的生长情况。结果显示，该成年大鼠类胰岛干细胞在裸鼠体内不具有明显致瘤性。

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1 胰岛干细胞研究进展

1.1 胰岛的发育

1.2 胰岛干细胞的概念

1.3 胰岛干细胞的种类

1.4 胰岛干细胞的体外培养及鉴定

1.5 胰岛干细胞的主要生物学特性

1.6 结语

2成年大鼠类胰岛干细胞分离培养的研究

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

2.4 小结

3 FBS和四种生长因子对成年大鼠类胰岛干细胞体外增殖的影响

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

3.4小结

4 成年大鼠类胰岛干细胞的主要生物学特性及其致瘤性

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

4.4 小结

5结论

参考文献

致谢

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