成年大鼠类胰腺导管干细胞的分离与培养

摘要

糖尿病是一种严重危害人类健康的代谢性疾病，而传统的药物和胰岛素治疗方法却不能根治该病。近年来，随着移植技术的发展和免疫抑制剂的改进，胰岛移植治疗糖尿病取得了一定的疗效，但是由于供体来源短缺，胰岛移植治疗糖尿病技术的应用受到了制约。胰腺干细胞是存在于胰腺组织中的成体干细胞，能够自我更新并具有多向分化潜能。出生后，胰腺导管组织仍然存在干细胞，称为成体胰腺导管干细胞。体外分离增殖胰腺导管干细胞并诱导其分化形成功能性胰岛移植治疗糖尿病，是有效解决供体短缺的途径之一，具有重要的意义。但是，国内至今尚无成年哺乳动物胰腺导管干细胞建系的研究。本研究以SD成年大鼠为试验材料，建立了1例类胰腺导管干细胞系，并对其分离培养体系、生长特性、表达特性及裸鼠荷瘤等进行了探讨。成年大鼠类胰腺导管干细胞系的建立和生物学特性的研究，对于进一步研究成年哺乳动物胰腺组织再生和利用细胞移植治疗糖尿病具有重要的学术意义和潜在的应用价值。
　　本研究的主要内容包括：
　　1．成年大鼠类胰腺导管干细胞系的建立
　　以成年大鼠胰腺组织为试验材料，0.1 g/mLⅣ型胶原酶消化胰腺组织获得单个胰腺细胞，Dextron葡聚糖不连续密度梯度离心分离得到胰腺导管细胞。RPMI-1640+10％FBS+0.11 g/L丙酮酸钠+2.383 g/L Hepes基础培养液培养，原代上皮样胰腺导管干细胞和少量成纤维细胞贴壁生长。0.25%胰蛋白酶+0.04 g/L EDTA·2Na消化传代，逐渐剔除成纤维样细胞及其它细胞，获得纯化的上皮样胰腺导管干细胞。克隆环挑选单个细胞增殖而来的细胞簇，采用基础培养液+10 ng/mL EGF扩增培养，传代，建立1例成年大鼠类胰腺导管干细胞系。该细胞系已传至33代。倒置显微镜下观察类胰腺导管干细胞贴壁生长，呈多角形上皮样；当生长至80%融合时，呈“铺路石”样。传代培养1~2 d，细胞生长缓慢，3~4 d，细胞开始倍增。从干细胞生长曲线和传代情况看，该成年大鼠类胰腺导管干细胞具有无限增殖潜能。
　　以80%RPMI-1640+10%FBS+10%DMSO为细胞保存液，采用4℃，30 min→－80℃，12 h→－196℃程序性降温，液氮中已冷冻保存成年大鼠类胰腺导管干细胞86管，1×109个细胞；37℃水浴迅速解冻，成年大鼠类胰腺导管干细胞解冻成活率≥90.8%。
　　随机取传至31代的成年大鼠类胰腺导管干细胞扩增至单层，加入终浓度为0.1μg/mL的秋水仙素处理细胞5 h，0.4%氯化钾低渗30 min，固定，滴片，染色，制备染色体标本。结果显示成年大鼠类胰腺导管干细胞染色体是正常的二倍体（2n=42）。
　　2．不同生长因子对成年大鼠类胰腺导管干细胞增殖的影响
　　以RPMI-1640+10%NBS为基础培养液，分别添加浓度为5、10、15 ng/mL的生长因子EGF、bFGF、IGF-Ⅱ或KGF，扩增成年大鼠类胰腺导管干细胞。采用CCK-8法测定第1~7 d的细胞数，绘制细胞生长曲线。结果显示在基础培养液中添加这些生长因子均能促进成年大鼠类胰腺导管干细胞增殖，其中，添加15 ng/mL EGF或10、15 ng/mL bFGF或10、15 ng/mL KGF，能够显著促进成年大鼠类胰腺导管干细胞增殖。
　　3．成年大鼠类胰腺导管干细胞的表达特征
　　随机取传至22代的成年大鼠类胰腺导管干细胞，采用免疫荧光化学反应和流式细胞术检测其蛋白表达特性。免疫荧光化学反应结果显示成年大鼠类胰腺导管干细胞表达 CK19，不表达胰岛干细胞标记物（Nestin、Ngn3、Ptf1a、NeuroD2、Pdx-1）、神经干细胞标记物（Sox-2）、胚胎干细胞标记物（Ghrelin）及胰腺终末分化细胞标记物（Somatostatin、Secretin、Insulin、Glucagon、AKP）。流式细胞术检测结果显示成年大鼠类胰腺导管干细胞表达Pax4、Pax6、Oct-4、Nanog和PCNA，不表达胚胎干细胞标记物CD15/SSEA-1、胰岛干细胞标记物MafA和造血干细胞标记物（CD34、CD117/c-kit及CD45）。
　　4．成年大鼠类胰腺导管干细胞裸鼠荷瘤试验
　　随机取传至16代的成年大鼠类胰腺导管细胞，以1×107个细胞/0.2mL/site的量接种在裸鼠背部皮下，SPF环境中正常饲养30 d，观察裸鼠精神状态、活动力。结果成年大鼠类胰腺导管干细胞在裸鼠体内未长出瘤状物。

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目录

1 胰腺干细胞的概念和存在部位

1.1 哺乳动物胰腺的发育和组织结构

1.2 胰腺导管干细胞的概念和存在依据

2 胰腺导管干细胞的分离培养

2.1 胰腺导管干细胞的分离与扩增

2.2 影响胰腺导管干细胞分离培养的因素

3 胰腺导管干细胞的形态、增殖及表达特性

3.1 胰腺导管干细胞的形态特征

3.2 胰腺导管干细胞的增殖

3.3 胰腺导管干细胞的表达特性

4 胰腺导管干细胞的分化特性

4.1 胰腺导管干细胞的多向分化潜能

4.2 胰腺导管干细胞定向分化形成功能性胰岛

4.3 胰腺导管干细胞的致瘤性

5 成年大鼠类胰腺导管干细胞的分离和培养

5.1 材料与方法

5.2 结果与分析

5.3 讨论

5.4 小结

6 影响成年大鼠类胰腺导管干细胞增殖的细胞因子

6.1 材料与方法

6.2 结果与分析

6.3 讨论

6.4 小结

7 成年大鼠类胰腺导管干细胞的表达特性

7.1 材料与方法

7.2 结果与分析

7.3 讨论

7.4 小结

8 成年大鼠类胰腺导管干细胞的荷瘤试验

8.1 材料与方法

8.2 结果与分析

8.3 讨论

8.4 小结

9 结论

参考文献

附 录

致谢

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