牡蛎蛋白肽的酶法制备及其改善小鼠学习记忆功能的研究

摘要

本研究以近江牡蛎为原料，选用中性蛋白酶水解牡蛎蛋白制备牡蛎蛋白酶解肽；初步探讨改善学习和记忆功能与抗氧化活性之间的联系；采用膜分离、凝胶层析分离等技术对牡蛎蛋白酶解肽进行分离纯化；探讨了超滤组分对东莨菪碱所致学习记忆障碍小鼠的改善功能及机制，最后对分离组分的理化特性及PC12细胞活性进行研究。旨在提高牡蛎蛋白资源利用率，开发新的功能食品，为牡蛎资源高值化利用开辟新途径。
　　（1）研究前处理方法、E/S、pH值、温度和时间对中性蛋白酶水解牡蛎蛋白的影响，制备牡蛎蛋白酶解肽（EHOP），分析其分子量分布，体外试验测定其抗氧化活性。结果表明：酶解前100℃热处理10min能够提高酶解液中蛋白肽的含量，E/S为2.0％、pH7.0、温度50℃、时间3.0h为酶解的适宜条件，其DH达到14.95%，所制备的EHOP的主要成分为小分子肽类物质，分子量主要集中在500～3091Da。EHOP的还原性较强，对?OH和超氧阴离子自由基均有较好的清除能力，EHOP浓度为25mg/mL时，其还原力A700为0.44，?OH清除率和超氧自由基清除率分别达到21.2%和68.9%。
　　（2）采用动物实验探讨EHOP改善小鼠空间学习和记忆能力及其抗氧化活性。EHOP按剂量5g/kg.d给4周龄小鼠灌胃4周后，通过Morris水迷宫方法考察了EHOP对小鼠空间学习和记忆功能的影响，并检测小鼠血浆、肝组织和脑组织中SOD活性及MDA含量。结果表明，与空白组相比，EHOP组小鼠的潜伏期（18.97±3.84s）明显缩短，采用空间搜索策略的比例、穿越平台的次数、目标象限停留的时间和路程均有不同程度的增加，证实EHOP具有显著改善小鼠学习和记忆功能。与空白组相比，EHOP能够显著增强小鼠肝组织中SOD活性（P<0.005），显著性减少脑组织及血浆中的MDA含量均（P<0.005），结果显示，EHOP体内抗氧化活性同改善记忆能力有相关性。
　　（3）采用超滤法对EHOP进行纯化，得到组分A（＞10kDa）、组分B（10KDa～5kD）和组分C（<5kDa）三个组分，腹腔注射东莨菪碱建立急性学习记忆障碍模型，采用Morris水迷宫考察了超滤组分对东莨菪碱所致学习记忆障碍的改善功能，并通过测定小鼠大脑中MDA含量、SOD活性、MAO活性和AchE活性，初步探讨了其改善学习记忆机理。结果表明：与模型组相比，各给药组小鼠潜伏期明显降低，其中H-组分B和 L-组分C对实验小鼠的空间学习能力提高效果较为明显；空间探索试验中，H-组分B和H-组分C对东莨菪碱致记忆障碍小鼠的记忆保持能力有一定的改善作用。与模型组相比，高、低剂量的组分B和组分C均能显著降低小鼠大脑中的MDA含量（P<0.05），而仅H-组分A组的SOD活力显著提高（P<0.05），其余各组没有显著差异（P>0.05）；与模型组相比，各给药组的AChE活力显著性降低（P<0.05），且与阳性对照组相比没有现在差异（P<0.05）；相对于模型组，仅L-组分A组、H-组分A和L-组分C组的MAO活力显著降低（P<0.05），其余各组均作用不显著（P>0.05）。
　　（4）采用凝胶层析法对组分C组分进一步分离纯化；以低分化的PC12细胞及H2O2损伤的PC12细胞模型作为研究对象，显微镜观察EHOP、组分C及分离组分P1、P2、P3、P4对PC12细胞的生长增殖、分化的影响，采用MTT法测定其存活率，研究EHOP及其分离组分对氧化损伤细胞的修复和保护作用。结果如下：Sephadex G-25的分离条件为：超纯水作流动相，流速1.0ml/min，上样量0.5ml，柱压0.03MPa；组分C分离可得到四个组分，其中P3含量最高。高剂量组（800ug/mL）和低剂量组（400ug/mL）的EHOP和P3均能显著提高细胞的存活率（P<0.05），而其余实验组与对照组相比，结果无明显差别（P>0.05）。800ug/mL的EHOP、组分C和P3组分诱导PC12细胞7天后，未见有明显的突起长出，细胞形态没有显著性差异，但与空白组相比，其生长密度明显增大，具有提高细胞的生长增殖能力。另外，800ug/mL的P3组分对H2O2损伤细胞具有显著的保护修复作用，细胞存活率分别从（57.57±0.90）%提高至（61.06±1.22）%(P<0.05)。
　　总结论：本研究证实了热处理能够提高酶解活性肽的效率，酶解制备的牡蛎蛋白酶解物（EHOP）的主要成分为低分子肽类物质，体外试验表明EHOP具有良好的抗氧化活性。动物试验结果表明，EHOP具有改善正常小鼠及东莨菪碱所致障碍小鼠的学习记忆功能，且抗氧化活性强，其作用机理可能与清除自由基、降低脑组织氧化损伤作用密切联系，与调节脑组织中的神经递质（胆碱能）有关；EHOP对PC12细胞具有促生长增殖作用，但未能促进其分化，对H2O2损伤的PC12细胞具有显著的保护修复作用。

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1 绪论

1.1 学习和记忆的形成机制及其影响因素

1.2 学习记忆的实验评价方法

1.3 改善学习记忆功能的天然活性物质研究进展

1.4 牡蛎加工利用及其活性物质的研究进展

1.5 研究目的意义及主要研究内容

2 牡蛎蛋白酶解肽的制备工艺研究

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

2.4本章小结

3 EHOP的改善学习记忆功能及抗氧化活性研究

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

3.4 本章小结

4 EHOP超滤组分对东莨菪碱所致学习记忆障碍小鼠的改善作用

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

4.4 本章小结

5 EHOP组分C的分离纯化及促进神经细胞增殖活性的研究

5.1 材料与方法

5.2 结果与分析

5.3 讨论

5.4 本章小结

6 结论与展望

6.1研究结论

6.2研究展望

参考文献

致谢

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