Ⅱ相关键解毒酶介导的对虾中常见真菌毒素危害控制效应

摘要

T-2毒素、黄曲霉毒素B1(AFB1)、呕吐毒素(DON)和赭曲霉毒素(OTA)是霉菌生长产生的有毒代谢产物，属对虾饲料中自然发生的常见真菌毒素，毒性强，不易清除，性质稳定，可引起对虾疾病的发生以及生产性能下降、品质降低等，给对虾产业发展带来极大危害，造成巨大经济损失的同时也具有潜在的食品安全风险，有效控制其危害是亟待解决的热点问题。因此，本研究根据生物转化的原理，从诱导剂着手，通过Ⅱ相关键解毒酶的诱导表达，使对虾体内毒素残留量降低，病理损伤减轻，以达到降低常见真菌毒素的危害控制的目标。
　　总体研究思路是根据毒理学设计原理，采用剂量递增法进行试验设计，T-2、AFB1、DON和OTA四种真菌毒素的初始染毒剂量分别为4.8、1.2、6.0和1.78 mg/kg作为起始染毒剂量，每天染毒，4天为一周期，每期递增1.5倍，连续染毒20天，并设置空白对照。另设置单独诱导剂组，以槲皮素、芦丁和茶多酚为诱导剂，同样根据递增量原则，其中槲皮素的初始添加量为饲料量的0.2％，芦丁为0.3％，茶多酚为0.04％，添加到饲料中的量按照2倍量递增，进行20天试验。同时设置诱导剂和毒素共同作用组，来研究Ⅱ相关键解毒酶介导的对虾中常见真菌毒素危害控制效应。
　　主要从以下几方面考察真菌毒素导致的危害，比较诱导前后的危害变化，进而探明诱导对虾中常见真菌毒素危害的内源酶控制性技术。
　　首先，从对虾生理特性的角度（存活率、增重率和摄食率等）考察，结果发现:四种毒素（T-2、AFB1、DON和OTA）均能导致对虾存活率降低，增重率、特定增长率和摄食率下降。在本研究的染毒剂量下，AFB1染毒对虾组的存活率最低，增重率和特定增长率最慢，摄食率也最小。
　　通过20天剂量递增染毒，T-2和DON毒素蓄积系数分别为4.26和3.76，属于中等蓄积;KAFB1为2.24，明显蓄积，且通过LC-MS/MS在T-2、AFB1、DON和OTA染毒对虾体内检测到毒素残留，表明T-2、AFB1、DON和OTA毒素在对虾体内不仅存在物质蓄积，还有功能蓄积。
　　其次，从病理组织学角度考察，结果表明:饲喂对虾，从对虾的肌肉、肝胰腺和肠道组织显微结构可以看出，四种毒素染毒对虾，随着累积染毒剂量的加大，病理损伤越严重，具有剂量依赖性。主要表现在肌肉肌纤维受损、肌节分离、肌间隙变大甚至断裂，最严重时出现溶融现象;肝胰腺基底膜脱落，细胞结构紧密性被破坏，肝小体受损，细胞溶解和细胞核消失;肠道主要是上皮黏膜褶皱变少，随着染毒的进行肠道壁可见炎症，严重时肠管组织分离，结构疏松，肌层变薄，呈现溶解状态。
　　第三，从Ⅱ相关键酶入手，通过真菌毒素和诱导剂分别单独对对虾体内关键Ⅱ相关键酶的活力进行测定测定，结果表明，四种真菌毒素主要抑制对虾体内SULT和AANAT酶活，T-2毒素抑制递增染毒对虾肌肉中GSTs酶活表达，但在低剂量下(0.5mg/kg)能够激活20天蓄积染毒对虾肌肉中的GSTs基因表达;相反诱导剂对SULT和AANAT酶活的诱导效应大于GSTs、UGT和MT酶。之后通过诱导剂和毒素共同作用，发现诱导剂能够诱导染毒对虾体内SULT和AANAT酶活升高。
　　最后，采用统计学分析，通过对诱导剂和毒素共同作用对虾生长指标的测定，对比单独毒素作用对虾的生长指标，发现诱导剂能够减低毒素对对虾的生长危害，且能减少对虾体内毒素残留量，对染毒对虾的病理组织有一定的修复作用。不同诱导剂激活对虾不同部位的不同酶。
　　结论，(1)四种毒素均能导致对虾存活率降低，增重率、特定增长率和摄食率下降，其中AFB1毒素的作用强度最大;四种毒素均能导致对虾肌肉、肝胰腺和肠道不同程度的受损，随着累积染毒剂量的增加，肌间隙越来越大，片状化逐渐加重，细胞核消失，到后期甚至出现溶融状态;肝胰腺肝小体结构受损，细胞溶解，细胞核消失;肠道壁可见炎症，严重时肠管组织分离。(2)对虾组织中存在毒素残留，其中在对虾肌肉、虾头和血液中含量最多，T-2和DON毒素对对虾的累积染毒蓄积为中等蓄积，AFB1为明显蓄积，而20天染毒试验结束时，OTA组对虾死亡未超过一半，蓄积作用不明显。(3)真菌毒素对对虾体内SULT和AANAT酶抑制作用最强，三种诱导剂能够诱导SULT和AANAT酶活，诱导剂和毒素共同作用对虾组织器官中毒素残留量降低，且SULT和AANAT为主要诱导对象，诱导剂对毒素引起的病理结构损害有一定的修复功能，能够降低毒素对对虾生长指标的危害，SULT是对虾体内主要毒素代谢酶。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 绪论

1．1 真菌毒素的危害和污染状况

1．1．1 T-2毒素介绍

1．1．2 AF毒素介绍

1．1．3 DON毒素介绍

1．1．4 OT毒素介绍

1．2 生物体内Ⅱ相关键解毒酶

1．3 本课题研究目的、内容和意义

1．3．1 研究目的

1．3．2 研究内容

1．3．3 研究意义

2 四种常见真菌毒素对对虾的危害

2．1 材料与仪器

2．1．1 样品

2．1．2 试剂

2．1．3 仪器与设备

2．2 试验方法

2．2．1 待测真菌毒素染毒对虾

2．2．2 对虾生长特性的测定

2．2．3 定期递增剂量法测定毒素的蓄积系数K值

2．2．4 定期递增剂量染毒对虾体内真菌毒素残留测定

2．2．5 组织病理学分析

2．3 结果

2．3．1 四种真菌毒素对凡纳滨对虾生长特性指标的影响

2．3．2 递增剂量法K值的测定

2．3．3 染毒对虾体内毒素残留的测定

2．3．4 四种真菌毒素毒素对对虾显微结构的影响

2．4 分析和讨论

2．4．1 四种真菌毒素对对虾的危害

2．4．2 结论

3 四种真菌毒素对对虾Ⅱ相关键解毒酶活的影响

3．1 材料与仪器

3．1．1 样品

3．1．2 试剂

3．1．3 仪器与设备

3．2 实验方法

3．2．1 对虾Ⅱ相关键解毒酶的测定

3．3 实验结果

3．3．1 T-2毒素定期剂量递增染毒对对虾Ⅱ相关键解毒酶活的影响

3．3．2 AFB1毒素对虾Ⅱ相关键解毒酶活变化规律

3．3．3 DON毒素对虾Ⅱ相关键解毒酶活变化规律

3．3．4 OTA毒素诱导对虾Ⅱ相关键解毒酶活变化规律

3．4 分析与讨论

3．5 结论

4 T-2毒素对对虾肌肉GSTs酶基因表达的影响

4．1 材料与仪器

4．1．1 样品

4．1．2 试剂

4．1．3 仪器与设备

4．2 实验方法

4．2．1 T-2毒素蓄积染毒对虾

4．2．2 对虾肌肉总RNA的提取

4．2．3 RNA质量和完整性的检测

4．2．4 引物设计

4．2．5 RT-qPCR的进行

4．2．6 数据分析

4．3 结果

4．3．1 T-2毒素对肌肉中GSTs基因表达的影响

4．4 讨论

4．5 结论

5 诱导剂对Ⅱ相酶活的诱导作用

5．1 材料与仪器

5．1．1 样品

5．1．2 试剂

5．1．3 仪器与设备

5．2 实验方法

5．2．1 对虾Ⅱ相关键解毒酶的测定

5．3 结果

5．4 分析与讨论

5．5 结论

6 诱导剂和真菌毒素对凡纳滨对虾Ⅱ相酶的联合作用效应

6．1 材料与仪器

6．1．1 样品

6．1．2 试剂

6．1．3 仪器与设备

6．2 实验方法

6．2．1 诱导剂作用染毒对虾

6．2．2 诱导剂作用的染毒对虾Ⅱ相关键解毒酶的测定

6．3 结果

6．3．1 诱导剂对染T-2毒素对虾中Ⅱ相酶活的影响

6．3．2 诱导剂对染AFB1毒素对虾中Ⅱ相酶活的影响

6．3．3 诱导剂对染DON毒素对虾中Ⅱ相酶活的影响

6．3．4 诱导剂对染OTA毒素对虾中Ⅱ相酶活的影响

6．4 分析与讨论

6．5 结论

7 诱导剂对真菌毒素危害的控制

7．1 材料与仪器

7．1．1 样品

7．1．2 试剂

7．1．3 仪器与设备

7．2 实验方法

7．2．1 诱导剂作用染毒对虾

7．2．2 对虾生长特性的测定

7．2．3 诱导剂和毒素共同作用对对虾体内真菌毒素残留量的测定

7．2．4 组织病理学分析

7．3 结果

7．3．1 对虾生长特性的测定

7．3．2 诱导剂和毒素共同作用对对虾体内真菌毒素残留量的影响

7．3．3 诱导剂诱导Ⅱ相酶对毒素引起对虾病理损伤的修复效应

7．4 结论

8 总结

8．1 毒素危害的共性和差异

8．2 不足之处与展望

参考文献

致谢

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