雷州半岛红树林区仔稚幼鱼多样性及弓背青鳉对壬基酚的响应

摘要

雷州半岛位于中国大陆最南端，是中国第三大半岛，拥有中国最丰富的红树林资源。纵横交错的红树林孕育了丰富的鱼类资源，具有较高的生物多样性。鉴于日益严峻的环境问题，本课题对当前环境下的雷州半岛红树林区早期发育阶段鱼类进行了周年普查。于2014年4月至2016年6月在廉江市高桥国家级红树林保护区、遂溪县下六镇红莳地红树林区、雷州市附城镇北家村红树林保护区、雷州市九龙山国家红树林湿地公园共采集到仔稚幼鱼1683尾，鉴定为57种，并对其中的22种虾虎鱼进行了系统发育分析，阐述了雷州半岛东、西岸红树林区的中国新记录种湖栖鳍虾虎鱼（Gobiopterus lacustris）的群体分化情况。而后对雷州半岛近岸的高桥国家级红树林保护区、北和镇珍稀动物保护区、流沙湾、海湾大桥西南侧、观海长廊人造红树林区、东海岛红树林区、附城镇北家村红树林区、九龙山红树林国家湿地公园8个样点海水环境中的环境雌激素进行了定性分析。选取红树林区的优势物种弓背青鳉（Oryzias curvinotus）进行转录组高通量测序，对其中的Chg H、Chg L、ESR1基因进行验证，并分析了其在内分泌干扰物壬基酚的暴露处理下的表达情况。结果分述如下：
　　1.利用DNA条形码技术结合形态分类共鉴定出仔稚幼鱼57种，其中鲈形目占78.57%，而虾虎鱼科占鲈形目61.37%。优势物种包括湖栖鳍虾虎鱼(Gobiopterus lacustris）、萨摩亚瓢鳍虾虎鱼（Sicyopterus pugnans）、小口拟虾虎鱼（Pseudogobius masago）、阿部氏鲻虾虎鱼（Mugilogobius abei）、弓背青鳉（Oryzias curvinotus）、玛丽双边鱼（Ambassis marianus）等。时空分布规律上，春季（2-4月）物种数最多（45种），秋季（8-10月）物种数最少（14种）；四个站点中下六物种最多（37种），高桥物种数最少（23种）。生态类群以海洋洄游性鱼类为主。
　　2.获得了22种虾虎鱼类的88条COI序列，用于分析的528bp序列中，保守位点311个，变异位点217个，简约信息位点207个，单一突变位点10个。T、C、A和G四种碱基分布频率分别为30.3%、28.2%、23.4%和18.1%，其中碱基T偏倚于密码子的第2位点（43%）。22种虾虎鱼类88条序列共存在58个单倍型，单倍型多样性为0.984±0.005。寡鱗虾虎鱼属未定种（Oligolepis sp）与瓢虾虎鱼属未定种（Sicydium sp）亲缘关系最近，其种间遗传距离最小为0.004。而普氏细棘虾虎鱼（Acentrogobius pflaumii）与犬齿背眼虾虎鱼（Oxuderces dentatus）亲缘关系最远，遗传距离为0.277。
　　3.采集的高桥、下六、东海岛、附城、九龙山5个湖栖鳍虾虎鱼群体中，附城群体遗传多样性最高，九龙山群体遗传多样性最低。雷州半岛东岸3个群体与西岸2 个群体存在明显的群体分化，东、西岸群体基因交流较弱。分子方差分析揭示群体内遗传变异丰富。
　　4.利用ChgH-GFP转基因海水青鳉胚胎活体检测结果发现仅观海长廊城市排污口的红树林区、流沙镇流沙东村红树林区存在环境雌激素污染，而绝大部分样点均存在增强雌激素活性的物质。
　　5.Illumina Sequencing高通量测序结果表明雌、雄弓背青鳉成体肝脏样本各获得了Clean reads80095044条和87043984条，碱基错误率均为0.02%。在雌、雄弓背青鳉中均表达的有26588个基因，而差异表达分析发现仅在雄性个体中表达的有14285个基因，仅在雌性个体中表达的基因有3111个。经荧光定量PCR验证Chg H、Chg L、ESR1基因在雌、雄弓背青鳉中的相对表达量趋势与转录组数据基本一致，而ESR2在雌性弓背青鳉中的表达约为雄性的2.70倍。
　　6.选取实验室繁育的90d生长状态一致的弓背青鳉F1代雌、雄个体，利用10nM、100nM、1000nM的壬基酚（NP）暴露处理5d。10nM处理组，雄鱼的Chg H（P<0.01）、Chg L（P<0.05）、ESR2（P<0.01）基因表达均显著性下调，而雄鱼的ESR1虽然也有所下调但无显著性差异，雌鱼Chg H（P>0.05）、Chg L（P>0.05）、ESR1（P>0.05）也较对照组有所下调，ERS2（P>0.05）上调，但均无显著性差异。100nM处理组，雌、雄弓背青鳉4个雌激素相关基因相对表达量在10nM基础上均有上调趋势，其中雌鱼中Chg H（P<0.05）、ESR2（P<0.01）均呈现显著上调，雄鱼中Chg L（P<0.05）、ESR1（P<0.01）、ESR2（P<0.01）均在10nM NP处理的基础上上调了。1000nM时，雄鱼ESR1（P<0.05）和ESR2（P<0.01）基因显著下调。总体而言，弓背青鳉成鱼肝脏中Chg L基因对壬基酚更敏感，其中100nM壬基酚暴露处理时的表达量最高。

目录

1 文献综述

1.1雷州半岛鱼类资源现状

1.2转录组高通量测序技术研究进展

1.3环境内分泌干扰物对鱼类的影响

1.4研究思路与方法、技术路线

1.5研究目的和意义

2 基于DNA条形码技术的雷州半岛红树林海区仔稚幼鱼多样性研究

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

3 基于COI基因的雷州半岛虾虎鱼类序列变异及系统进化

3.1材料与方法

3.2结果

3.3讨论

4 基于D-loop区的雷州半岛东、西岸红树林区湖栖鳍虾虎鱼群体分化研究

4.1材料与方法

4.2结果

4.3讨论

5 雷州半岛红树林区环境雌激素的生物检测

5.1材料与方法

5.2结果

5.3讨论

6 弓背青鳉转录组测序获得的雌激素相关基因差异表达验证及壬基酚暴露影响

6.1材料与方法

6.2结果

6.3讨论

结论

研究展望

参考文献

附录1 注释表

附录2 雷州半岛57种仔稚幼鱼类分类地位

附录3 雷州半岛红树林区仔稚幼鱼生态图片

致谢

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