南极磷虾蛋白源二肽基肽酶-Ⅳ(DPP-Ⅳ)抑制肽的研究

摘要

糖尿病已成为继恶性肿瘤、心血管之后，第三大严重威胁人类健康和生命的代谢性疾病，它能引发脑血管疾病、冠心病、视网膜病变等多种并发症，甚至死亡。目前，糖尿病的控制与治疗主要是依靠食物控制和药物。治疗糖尿病的药物主要是人工合成的药物，它们都有一定的毒副作用。肠促胰岛素药物中的DPP-IV抑制肽无论是从有效性还是安全性，对糖尿病都具有较好的疗效。来源于食品蛋白的DPP-IV抑制肽具有来源广泛、安全性高、降血糖效果好等优点，已成为关注和研究的热点。
　　南极磷虾生物量大，潜在资源蕴量约6亿吨。蛋白质含量高，单只虾的蛋白含量约为70.58%（干基）,富含人体所需的20种氨基酸，是制备DPP-IV抑制肽的良好资源。本论文以南极磷虾为原料，研究DPP-IV抑制肽的制备、分离纯化、活性评价与作用机制，为南极磷虾开发降血糖功能食品配料提供技术依据，主要研究内容与结果如下：
　　1、以 DPP-IV抑制率为主要评价指标，采用动物蛋白酶水解南极磷虾，首先考察了时间、温度、pH、酶添加量4个单因素对南极磷虾酶解产物DPP-IV抑制率和可溶性蛋白的影响，然后以采用响应面法对这4个因素进行了优化。结果表明，南极磷虾制备DPP-IV抑制肽最佳工艺参数为：酶解时间3.85h、温度45℃、pH值7.6、酶添加量237.6U/g，在此条件下DPP-IV抑制率为64.82%。
　　2、以荧光底物法（试剂盒法）测定的 DPP-IV抑制率为评价指标，采用醋酸钙沉淀法对南极磷虾酶解液进行脱氟处理，然后采用截留分子量分别5000Da，3000Da，100Da的超滤膜对其进行超滤分离，分子量为3000-100Da的超滤组分显示了较高DPP-IV抑制活性，它在Sephacryl S-100凝胶色谱柱上被分离为3个组分(F1，F2，F3)，其中高活性组分 F1采用反相高效液相色谱进一步纯化，获得了3个肽（F1-1，F1-2，F1-3）；纯化的肽通过氨基酸分析仪和三重四级杆飞行时间质谱（QTOF-MS）鉴定DPP-IV肽的氨基酸序列。结果表明，它们分别为Ala-Pro（AP）、Ile-Pro-Ala（IPA）和Ile-Pro-Ala-Val-Phe（IPAVF），DPP-IV抑制肽的 IC50分别为0.0530mg/mL,0.0370mg/mL和0.0730mg/mL。
　　3、采用固相合成法合成AP、IPA和IPAVF，采用HPLC与质谱法对其身份进行证实，结果表明：合成的3种肽与从南极磷虾中纯化到的3种DPP-IV抑制肽具有相同的氨基酸序列，且纯度较高；通过联合20g/L葡萄糖溶液浸泡和10%胆固醇喂养20天的方法，快速建立了稳定的糖尿病斑马鱼模型。并用该模型对AP、IPA和IPAVF进行体内活性评价，评价的理化指标为DPP-IV活性、葡萄糖、甘油三酯、胆固醇，基因指标为 Insa、Glucagon、Pck1基因。结果表明，AP、IPA和IPAVF对糖尿病斑马鱼都有一定的降血糖功效，且多肽浓度与降血糖效果呈正相关关系。在3种肽中，IPA的降血糖效果最好。
　　4、3种DPP-IV抑制肽（AP、IPA、IPAVF）对DPP-IV的抑制动力学进行了研究。结果表明： AP、IPA和IPAVF对DPP-IV抑制类型均为竞争性可逆性抑制；运用计算机软件模拟和分子对接方法，考察了AP、IPA和IPAVF3个DPP-IV抑制肽与 DPP-IV的相互作用，模拟出 IPA-DPP-IV、IPA-DPP-IV和IPAVF-DPP-IV三个对接模型，其中 IPA与 DPP-IV对接最好，表明 IPA对DPP-IV抑制作用效果最佳，IPA与 DPP-IV对接的主要结合部位在91-96和101-105号氨基酸残基。
　　5、以理化指标（DPP-IV活性、葡萄糖、甘油三酯、胆固醇）和相关基因（Insa、Glucagon、Pck1）表达水平为考察指标，采用糖尿病斑马鱼模型对3000-100Da南极磷虾酶解物进行了降血糖功效评价。综合理化指标和基因指标的测定结果，得出以下结论：1.35g/L和2.7g/L浓度的3000-100Da AKH的降血糖功效不是很明显。5.4g/L浓度的3000-100Da AKH具有一定的降血糖功效，但不及AP、IPA和IPAVF。

目录

声明

符号说明

1 绪论

1.1 糖尿病的危害与防治

1.2 DPP-IV抑制肽的研究进展

1.3 南极磷虾的资源特性

1.4 本课题的立项依据及目的意义

1.5主要研究内容及技术路线

2 南极磷虾DPP-IV抑制肽酶法制备工艺优化

2.1 材料与方法

2.2实验方法

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

3 南极磷虾DPP-IV抑制肽的分离纯化与结构鉴定

3.1材料与方法

3.2 实验方法

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

4 斑马鱼模型的建立与DPP-IV抑制肽体内活性评价

4.1 材料与仪器

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4本章小结

5 DPP-IV抑制肽与DPP-IV的作用机制

5.1 材料与仪器

5.2 实验方法

5.3 结果与分析

5.4本章小结

6 南极磷虾酶解产物降血糖功效评价

6.1 材料与仪器

6.2 实验方法

6.3 结果与分析

6.4 本章小结

7 结论与展望

7.1 主要结论

7.2 展望

参考文献

致谢

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