腺病毒介导的VEGF启动子-CD/TK融合基因系统的构建与体外抑瘤研究

摘要

目的:一、应用AdEasier-1系统制备含VEGF启动子驱动的CD/TK融合基因的重组腺病毒质粒,经293细胞包装、扩增获取重组腺病毒.行氯化铯密度梯度离心纯化,并行PCR鉴定.二、应用含VEGF启动子驱动的CD/TK融合基因的重组腺病毒感染LOVO细胞,在前药5-氟胞嘧啶(5-FC)和/或更昔洛韦(GCV)作用下,测定肿瘤细胞的细胞克隆形成率和细胞存活率以观察腺病毒介导的CD/5-FC和HSV-TK/GCV系统对大肠癌细胞的体外杀伤效应.方法:一、构建转移质粒pAdtrack-VEGFP-CDglyTK 首先,用Not Ⅰ和Xho Ⅰ切下pEGFP-1-SV-VEGFP上的VEGFP,亚克隆至pAdtrack构建pAdtrack-VEGFP.再分别以JM109细菌和pREP8-TK为模板,PCR扩增出CD和TK基因片段,亚克隆到中间载体pcDNA3构建含CDglyTK融合基因的pcDNA3-CDglyTK.用HindⅢ和Pvu Ⅱ酶切,回收纯化一大小约2.6kb、含polyA尾的片段CDglyTK-pA,插入到穿梭质粒pAdtrack-VEGFP上构建转移质粒pAdtrack-VEGFP-CDglyTK,行酶切鉴定.二、构建重组腺病毒质粒pAdEasy-VEGFP-CDglyTK 用PmeⅠ酶切线性化pAdtrack-VEGFP-CDglyTK,转化用氯化钙法制备的AdEasier-1感受态细菌,使pAdtrack-VEGFP-CDglyTK和腺病毒基因组pAdEasy-1在BJ5183细菌内进行同源重组.抽提质粒,行电泳和Pac Ⅰ酶切鉴定获取正确的重组腺病毒质粒pAdEasy-VEGFP-CDglyTK.三、293细胞包装、扩增重组腺病毒 用经Pac Ⅰ酶切线性化的重组腺病毒质粒pAdEasy-VEGFP-CDglyTK,按LipofectAMINE2000产品说明书转染293细胞,通过荧光显微镜观察GFP的表达情况.转染后第14d收集细胞,反复冻融(-70℃,1h/37℃,3min/振荡,lmin)4次收集病毒上清.取1/2病毒上清感染293细胞,5d后收集细胞,以相同的冻融法收集病毒上清.如此反复取病毒上清感染293细胞进行大量扩增(共4次),收集病毒上清.行氯化铯密度梯度离心法纯化并用紫外分光光度计测定重组腺病毒滴度.四、腺病毒介导的VEGF启动子-CDglyTK融合基因系统对LOVO细胞的体外杀伤作用 应用含VEGF启动子驱动的CDglyTK融合基因的重组腺病毒感染LOVO细胞,在前药5-氟胞嘧啶(5-FC)和/或更昔洛韦(GCV)作用下,测定肿瘤细胞的细胞克隆形成率和细胞存活率.结论:该研究应用AdFasier-1系统制备了含VEGFP驱动CD/TK自杀基因系统的重组腺病毒,并用获得的重组腺病毒感染LOVO细胞,在前药5-氟胞嘧啶(5-FC)和/或更昔洛韦(GCV)作用下,测定肿瘤细胞的细胞克隆形成率和细胞存活率,初步观察腺病毒介导的CD/5-FC和HSV-TK/GCV系统对大肠癌细胞的杀伤作用,得出如下结论:1、该实验于国内首先应用AdEasier-1系统构建重组腺病毒.2、利用AdEasier-1系统可以成功构建含VEGFP驱动CD/TK自杀基因系统的重组腺病毒,成功率为70％,重组腺病毒的滴度达3.2×10<'11>病毒颗粒/m1.3、重组腺病毒能将VEGFP驱动的CD/TK融合基因导入LOVO细胞中并进行有效表达,产生具有生物活性的前药转换酶大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶和单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶.4、联合应用CD/5-FC和HSV-TK/GCV系统的肿瘤杀伤效应比单独应用CD/5-FC或HSV-TK/GCV强.

目录

中英文对照缩略词

ABSTRACT

前言

技术路线

第一部分 应用AdEasier-1系统高效制备腺病毒介导的VEGF启动子-CD/TK融合基因系统

材料与试剂

实验方法

结果

讨论

第二部分 腺病毒介导的VEGF启动子-CD/TK融合基因系统对LOVO细胞的杀伤作用研究

材料和试剂

实验方法

结果

讨论

结论

参考文献

在读期间撰写文章一览表

综述 肿瘤自杀基因疗法的研究进展

1基因疗法的概述

1.1自杀基因疗法的定义

1.2自杀基因疗法的作用机理

2前药转换酶/前药体系

2.1单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦

2.2胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶

2.3水痘-带状疱疹病毒胸苷激酶/6-甲氧基阿糖核苷

2.4硝基还原酶/CB1954

2.5黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶/6-疏基黄嘌呤

2.6嘌呤核苷磷酸化酶/6-甲基嘌呤脱氧核苷

2.7人β葡萄糖醛酸甙酶/HMR1826

2.8 CYP2B1/环磷酰胺

2.9羧肽酶A/α-肽氨甲蝶呤

2.10羧肽酶G2/CMDA

2.11脱氧胞苷激酶/阿糖胞苷

2.12胸腺嘧啶磷酸化酶/5’-脱氧-5-氟尿苷

2.13融合自杀基因体系

2.14自杀基因与免疫基因联合应用

3腺病毒载体

3.1病毒的分子生物学特性

3.2腺病毒载体的种类及应用

3.3重组腺病毒质粒的构建方法

4结语

5参考文献

致谢